李培培， 張萬旭， 汪 強(qiáng)， 譚金芳， 韓燕來

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，河南 鄭州 450002)

1株高產(chǎn)γ-聚谷氨酸菌株的選育及培養(yǎng)基篩選

李培培， 張萬旭， 汪 強(qiáng)， 譚金芳， 韓燕來

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，河南 鄭州 450002)

從腐乳中分離篩選出1株產(chǎn)γ-PGA的菌株pga-1，經(jīng)過菌落形態(tài)、革蘭氏染色顯微成像及細(xì)菌16Sr DNA基因序列分析，確定其為枯草芽孢桿菌(Bacdllussubtilis).對(duì)該菌的抗逆性、生長及發(fā)酵最佳培養(yǎng)基進(jìn)行初步的研究和篩選.結(jié)果表明，經(jīng)過3個(gè)月的冷凍保藏后該菌生長旺盛，表現(xiàn)較強(qiáng)的抗逆性和穩(wěn)定性；搖瓶發(fā)酵產(chǎn)物純化后經(jīng)酸水解、高壓液相色譜檢測(cè)，表明其成分為單一谷氨酸，說明發(fā)酵產(chǎn)物為谷氨酸聚合物；用5種培養(yǎng)基進(jìn)行最優(yōu)種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基篩選，表明培養(yǎng)基A生長量最大，為最佳種子擴(kuò)繁培養(yǎng)基；富含谷氨酸鈉的培養(yǎng)基C為最佳發(fā)酵培養(yǎng)基,發(fā)酵72 h后，γ-聚谷氨酸的產(chǎn)量最高達(dá)到28.9 g·L-1.

γ-PGA菌株；培養(yǎng)基；生長曲線；產(chǎn)量

聚谷氨酸(γ-PGA)由L-谷氨酸(L-Glu)、D-谷氨酸(D-Glu)單體通過酰胺鍵聚合而成的一種多肽分子[1]，其特殊的化學(xué)結(jié)構(gòu)使其具有優(yōu)良的保水性能，在農(nóng)業(yè)上可用作保水劑.與傳統(tǒng)聚丙烯酰胺類化學(xué)保水劑相比，γ-PGA的吸水性能和保水性能要高1倍以上，能顯著提高干旱土壤種子發(fā)芽率[2]，且該種材料具有高度可生物降解性，其降解產(chǎn)物谷氨酸是植物生長的營養(yǎng)物質(zhì)，有利于土壤微生物和作物根系的吸收和利用，不會(huì)造成環(huán)境污染和不良的生態(tài)效果，是最具發(fā)展前景的生物材料之一[1].隨著中國干旱缺水問題的日趨加劇，水資源越來越成為制約農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要因素.γ-PGA主要用在醫(yī)藥、化工材料等方面，在抗旱節(jié)水方面的研究應(yīng)用國內(nèi)并不多見，日本科研人員采用γ-PGA吸水樹脂包裹牧草種子，撒于缺水沙地進(jìn)行綠化試驗(yàn)，1周后種子發(fā)芽生長良好[3,4].另外，在使用肥料、殺蟲劑、除草劑等時(shí)，加入適量的γ-PGA鹽可以延長它們?cè)谧饔脤?duì)象表面上的停留時(shí)間，不易因干燥、下雨而被沖刷掉.鑒于此，開展新型保水材料γ-PGA的開發(fā)和應(yīng)用，為干旱缺水地區(qū)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供廉價(jià)高效的保水產(chǎn)品，具有重要意義.

γ-PGA最初在炭疽芽孢桿菌的莢膜成分里被發(fā)現(xiàn)，后經(jīng)研究者不斷努力，利用芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)獲得純化的γ-PGA[1]，微生物合成法與其他合成方法相比具有成本低廉、過程簡(jiǎn)單、周期短、產(chǎn)量高等特點(diǎn).選育γ-PGA合成菌株的研究很多，但其研究目的同樣多集中于醫(yī)藥、化工等產(chǎn)業(yè)方面的應(yīng)用，而用于農(nóng)業(yè)保水材料的開發(fā)研究還比較少[5,6].本研究有針對(duì)性地篩選出γ-PGA合成菌株，并對(duì)其生長條件和發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行了系統(tǒng)的表征和鑒定，篩選菌株最佳菌體生長和發(fā)酵培養(yǎng)基，以提高γ-PGA產(chǎn)率，為規(guī)?；a(chǎn)生物保水產(chǎn)品提供參考.

1 材料和方法

1.1目標(biāo)菌株篩選

分離菌種材料：腐乳(王致和)、土壤等.菌株的篩選采用以下的方法：取少量樣品，用無菌生理鹽水稀釋，沸水浴5 min，放置冷卻.取上清液稀釋后吸取0.1 mL涂布于LB平板(酵母粉10 g·L-1，蛋白胨10 g·L-1，NaCI 5 g·L-1，pH值為7.0～7.2，固體加瓊脂粉20 g·L-1，0.1 mol Pa滅菌20 min)，于37 ℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)觀察24 h.挑選形態(tài)大、表面光滑、高黏濕潤的單菌落進(jìn)行連續(xù)的劃線培養(yǎng)，最終獲得純菌株.

1.2菌株鑒定

1.2.1 菌株形態(tài)特征 連續(xù)劃線培養(yǎng)獲得純菌株，觀察菌落形態(tài).挑取LB平板上少許菌體接種至LB液體培養(yǎng)基，于37 ℃ ，200 r·min-1振蕩培養(yǎng)14 h，菌液進(jìn)行革蘭氏染色，用顯微鏡(Nikon Eclipse 80i，日本)觀察并拍照.

1.2.2 細(xì)菌16Sr DNA鑒定 取5 mL培養(yǎng)24 h的菌液，8 000 r·min-1離心10 min，收集細(xì)胞，棄上清液，沉淀物提取微生物總DNA[7].用引物對(duì)27F(5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-ACGGCTACCTTGTTACGACT-3’)擴(kuò)增細(xì)菌的16Sr DNA序列全長，反應(yīng)體系參照takara產(chǎn)品Taq酶說明書.PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性10 min， 94 ℃ 1 min，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，26個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min.擴(kuò)增產(chǎn)物用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%的瓊脂糖電泳檢測(cè)目標(biāo)條帶.

PCR產(chǎn)物經(jīng)純化，由華大基因有限公司完成16Sr DNA的雙向測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用DNA star軟件進(jìn)行拼接，在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行核苷酸序列的Blast比對(duì)，得到相關(guān)菌株的16Sr DNA基因的核苷酸序列，利用MEGA 5.0軟件NJ(Neighbour Joining)法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹.

1.3培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

1.3.1 培養(yǎng)基 A：葡萄糖30 g·L-1，酵母膏8 g·L-1，三水磷酸氫二鉀2 g·L-1，硫酸鎂0.25 g·L-1， 谷氨酸鈉30 g·L-1，pH值7.5.

B:葡萄糖 54 g·L-1，硫酸銨9 g·L-1，三水磷酸氫二鉀2 g·L-1，硫酸鎂0.25 g·L-1， pH值7.5.

C: 酵母粉30 g·L-1，葡萄糖50 g·L-1，氯化銨7 g·L-1，谷氨酸鈉50 g·L-1，三水磷酸氫二鉀2 g·L-1， 硫酸鎂0.25 g·L-1，pH值7.0～7.5.

D: 檸檬酸10 g·L-1，谷氨酸鈉30 g·L-1，甘油80 g·L-1，氯化銨7 g·L-1，磷酸氫二鉀0.5 g·L-1，六水三氯化鐵0.05 g·L-1，二水氯化鈣0.15 g·L-1，七水硫酸鎂0.5 g·L-1，一水硫酸錳0.1 g·L-1，pH值7.0～7.5.

E: 葡萄糖 50 g·L-1，硫酸銨 2 g·L-1，硫酸鎂0.6 g·L-1，磷酸二氫鉀 6 g·L-1，磷酸氫二鉀 14 g·L-1，加2 mL微量元素.微量元素配方：硫酸亞鐵、氯化鈣、硫酸錳和硫酸鋅各1 mmol，pH值7.0～7.5.

1.3.2 培養(yǎng)方法 (1)種子培養(yǎng)：取活化菌種一環(huán)，接種于種子培養(yǎng)基，37 ℃，200 r·min-1，振蕩培養(yǎng)24 h.

(2)發(fā)酵培養(yǎng)：取1%種子培養(yǎng)液接入到裝有50 mL液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，37 ℃，200 r·min-1，振蕩培養(yǎng)84 h.

1.3.3 菌種保存 將篩選得到的菌株接入LB液體培養(yǎng)基，取對(duì)數(shù)生長期末期的菌液0.8 mL加入已高壓滅菌的含0.2 mL甘油的保存管中，-80 ℃保藏.

1.3.4 不同培養(yǎng)基條件下菌體生長特征 分別在250 mL三角瓶中配制50 mL的A，B，C和D 4種液體培養(yǎng)基，121 ℃滅菌20 min，冷卻后分別以0.5%的接菌量將菌液接種至液態(tài)培養(yǎng)基中，于37 ℃，200 r·min-1振蕩培養(yǎng)24 h，每隔2 h取樣檢測(cè)菌體在OD660 nm下的吸光值，記錄菌體的生長曲線.

1.3.5 菌株抗逆性及穩(wěn)定性 將保存于-80 ℃的菌種取出，接種到種子培養(yǎng)基中，不同取樣時(shí)間測(cè)定OD600下的吸光值，比較保存菌種與連續(xù)傳代菌種的生長曲線.

1.4γ-PGA產(chǎn)物的定性測(cè)定

振蕩培養(yǎng)48 h的幾種培養(yǎng)基的發(fā)酵產(chǎn)物，參考文獻(xiàn)[8]的方法進(jìn)行目標(biāo)產(chǎn)物的純化和分離. 得到的樣品用于后續(xù)的酸水解及液相色譜(Waters 515，美國)測(cè)定，具體步驟如下.

(1)取適量的樣品到水解管，加5 mL的6 mol·L-1的鹽酸到水解管中后，使用乙醇噴燈封口，110 ℃水解24 h，冷卻后用6 mol·L-1的NaOH溶液調(diào)pH值至9.0左右后移至50 mL容量瓶中.用超純水洗滌3次，定容，過濾后取濾液進(jìn)行柱前衍生后，使用反相高效液相色譜法分析L-谷氨酸含量.

(2)色譜條件：色譜柱：Ultimate Amino acid，5 μm，4.6×250 mm；流動(dòng)相A：V(0.1 mol·L-1醋酸鈉溶液)∶V(乙腈)=93∶7，流動(dòng)相B：V(水)∶V(乙腈)=20∶80，其中乙酸鈉溶液用冰醋酸調(diào)節(jié)pH值6.5，流動(dòng)相梯度洗脫程序見表1；柱溫：40 ℃；流速1 mL·min-1；檢測(cè)波長：254 nm；進(jìn)樣量：5 μL.

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

(3)柱前衍生：精確量取上述水解液或L-谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)液0.4 mL，置于離心管中，加入稀釋后的衍生劑A液0.2 mL，衍生劑B液0.2 mL后搖勻，在50 ℃水浴鍋中加熱45 min取出，待溫度降至室溫后加入正己烷0.4 mL搖勻，并用孔徑為0.45 μm有機(jī)膜過濾，放置30 min后，取澄清的下層液進(jìn)行高效液相色譜分析.

1.5不同發(fā)酵培養(yǎng)基的產(chǎn)量研究

分別在0，24，48，60，72和84 h取樣測(cè)定幾種發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物中γ-PGA的產(chǎn)量.經(jīng)上述純化分離后，冷凍干燥稱重.

2 結(jié)果與分析

2.1菌株形態(tài)特征

經(jīng)過連續(xù)的劃線培養(yǎng)，從3株外觀大而黏稠的菌株中選擇生長最旺盛的1號(hào)菌株(圖1-A)，菌體呈半透明狀，表面光滑.對(duì)1號(hào)菌進(jìn)行革蘭氏染色顯微鏡成像，菌株呈藍(lán)紫色(圖1-B)，為革蘭氏陽性菌，形態(tài)為桿狀.

圖1 菌落形態(tài)(A)及菌株革蘭氏染色顯微鏡成像(B)Fig.1 Colony morphology of pga-1 (A) and micrograh (B)

2.2菌株16SrDNA序列分析

細(xì)菌16Sr DNA全長擴(kuò)增測(cè)序后獲得基因序列1 460 bp，見圖2-A.與Genebank數(shù)據(jù)庫中DNA序列進(jìn)行比對(duì)，構(gòu)建該菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2-B).結(jié)果表明，菌株pga-1與枯草芽孢桿菌Bacillussubtilisstrain相似率最高，聚在一類，同源性高達(dá)99%，可將該菌定位為枯草芽孢桿菌.

圖2 菌株16Sr DNA相對(duì)分子質(zhì)量檢測(cè)(A)和基于16Sr DNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建(B)Fig.2 Molecular of 16Sr DNA sequence (A) and phylogenetic tree of bacteria based on the 16Sr DNA sequence (B)

2.3發(fā)酵目標(biāo)產(chǎn)物γ-PGA鑒定

A，B，C和D 4種培養(yǎng)基發(fā)酵48 h后，對(duì)4種培養(yǎng)基發(fā)酵樣品中的酸水解產(chǎn)物進(jìn)行定性的測(cè)定.其中培養(yǎng)基A的發(fā)酵物中，沒有檢測(cè)到谷氨酸，其余3種培養(yǎng)基發(fā)酵水解物中，目標(biāo)產(chǎn)物的檢出保留時(shí)間與谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)品一致，保留時(shí)間5.502 min，如圖3所示.表明發(fā)酵物中產(chǎn)物成分為谷氨酸聚合物，可以確定該菌株為聚谷氨酸產(chǎn)生菌，命名為pga-1.

幾種培養(yǎng)發(fā)酵水解產(chǎn)物中谷氨酸的檢出量分別為：A培養(yǎng)基為0 g·L-1,B培養(yǎng)基為1.74 g·L-1，C培養(yǎng)基為15.46 g·L-1，D培養(yǎng)基為10.65 g·L-1.以C和D培養(yǎng)基富含谷氨酸鈉作為發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)量最高.

圖3 高效液相色譜測(cè)定4種培養(yǎng)基發(fā)酵水解物中的谷氨酸含量Fig.3 Production of glutamic acid from hydrolysis of pga-1 fermentation using four medium detected by HPLC

2.4菌株在不同培養(yǎng)基條件下生長曲線

用A，B，C和D 4種不同的液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，在24 h的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，從菌株的生長曲線中可以看出(圖4)，培養(yǎng)基A生長量最大，在18 h達(dá)到最大值，之后進(jìn)入衰亡期，開始有菌體發(fā)生自溶現(xiàn)象，造成吸光值下降.其次為培養(yǎng)基C，在16 h達(dá)到最大值，生長速度最快.在培養(yǎng)基B和D中培養(yǎng)細(xì)胞生長量較小.結(jié)果表明，培養(yǎng)基A最有利于該菌株細(xì)胞增殖，可以作為該菌株的種子培養(yǎng)基，以便種子擴(kuò)繁，進(jìn)行規(guī)模化發(fā)酵.

圖4 不同培養(yǎng)基條件下菌株生長曲線Fig.4 Growing characteristics of pga-1 using four medium

2.5菌株抗逆性及穩(wěn)定性

將連續(xù)轉(zhuǎn)接傳代的菌株與-80 ℃保存3個(gè)月的菌株進(jìn)行生長曲線的比較，由圖5可以看出，冷凍保存的菌株活力旺盛，不需要經(jīng)過復(fù)壯，就能到達(dá)良好的生長能力，與連續(xù)傳代菌株沒有差異，表現(xiàn)較強(qiáng)的抗逆性和穩(wěn)定性.該菌株便于保存，為進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供了前提條件.

圖5 連續(xù)傳代和冷凍保藏菌株的生長曲線Fig.5 Growth curves of continuous passage culture and freezing preservation

2.6不同培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量

通過84 h內(nèi)發(fā)酵產(chǎn)物γ-PGA的純化和恒重測(cè)定，在相同的發(fā)酵條件下，前24 h幾種培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA產(chǎn)量均比較低，產(chǎn)物量的高峰均出現(xiàn)在60 h以后.B培養(yǎng)基在60 h到達(dá)產(chǎn)量最大值8.0 g·L-1，C培養(yǎng)基在培養(yǎng)第72 h產(chǎn)量達(dá)到最大值28.9 g·L-1，D培養(yǎng)基在48 h產(chǎn)量達(dá)到最大值14.9 g·L-1，E培養(yǎng)基在24 h產(chǎn)量達(dá)到最大值14.6 g·L-1，如圖6所示.由此可見，作為出發(fā)菌株，pga-1具有相當(dāng)可觀的產(chǎn)量，其中C培養(yǎng)基可以作為該菌株的優(yōu)選培養(yǎng)基，進(jìn)一步的菌株改造和發(fā)酵優(yōu)化.

圖6 不同培養(yǎng)基不同發(fā)酵時(shí)間γ-PGA產(chǎn)量動(dòng)態(tài)Fig.6 Dynamics of γ-PGA production fermented using different medium at different time

3 討論

本研究選育獲得1株高產(chǎn)聚谷氨酸合成菌株pga-1，經(jīng)形態(tài)分析和16Sr DNA序列鑒定為枯草芽孢桿菌，經(jīng)研究其適宜的發(fā)酵培養(yǎng)基，搖瓶水平下最高產(chǎn)量達(dá)到28.9 g·L-1.目前γ-PGA菌株篩選研究較多，獲得的菌株主要是芽孢桿菌屬的細(xì)菌[9]， HEZAYEN等[10]報(bào)道的1株嗜鹽古菌Natrialbaaegyptiacasp.也能產(chǎn)生γ-PGA，在生產(chǎn)中發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA的2種主要菌株為枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌.桑莉等[5]篩選到1株枯草芽孢桿菌在70 g·L-1的谷氨酸鈉底物條件下，γ-PGA產(chǎn)量最高，達(dá)到18.32 g·L-1，姚俊等[11]從土壤中篩選到1株枯草芽孢桿菌，在富含谷氨酸和葡萄糖的培養(yǎng)基上搖瓶發(fā)酵最高產(chǎn)γ-PGA 26 g·L-1，還有研究者[12]采用射線誘變的方法對(duì)1株地衣芽孢桿菌進(jìn)行改造并優(yōu)化，其γ-PGA產(chǎn)量為18.9 g·L-1，國外報(bào)道的較好的γ-PGA出發(fā)菌株的最高產(chǎn)量也多在20～30 g·L-1[1,13].與前人研究相比，本研究獲得的γ-PGA合成菌株發(fā)酵產(chǎn)量較高，且抗逆性強(qiáng)，經(jīng)過菌株改造或發(fā)酵條件優(yōu)化預(yù)期將獲得更高的產(chǎn)量.

前人研究將γ-PGA產(chǎn)生菌分為2類，1類是谷氨酸依賴型，另一類是谷氨酸非依賴型[13，14]，而谷氨酸依賴型又可分為2小類，1類需大量谷氨酸才能合成γ-PGA；另一類只需少量谷氨酸就能合成γ-PGA,目前的研究多集中在谷氨酸依賴型菌株上[14].本研究所得菌株用含谷氨酸底物的培養(yǎng)基C和D發(fā)酵(底物谷氨酸鈉含量分別為50 g·L-1和30 g·L-1)，γ-PGA的產(chǎn)量較高，其中50 g·L-1谷氨酸鈉底物含量的C培養(yǎng)基中產(chǎn)量最高.培養(yǎng)基B和E中盡管無谷氨酸底物，也能合成少量的γ-PGA，可以判斷該菌株為谷氨酸非依賴型合成菌，且可以被谷氨酸鈉誘導(dǎo)使產(chǎn)量提升.盡管非依賴型菌株比依賴型菌株合成產(chǎn)量低得多，但由于發(fā)酵培養(yǎng)基中無需添加谷氨酸底物，大大降低了生產(chǎn)成本，日益為研究者所關(guān)注，搖瓶水平下非依賴性菌株的合成產(chǎn)量也達(dá)到了可觀的水平[14，15]，這也為非依賴型γ-PGA微生物合成工業(yè)化生產(chǎn)提供了可能.因此在以后的發(fā)酵試驗(yàn)中，將重點(diǎn)研究菌株pga-1對(duì)谷氨酸前體依賴程度及提高合成產(chǎn)量，選擇成本低廉的底物進(jìn)行發(fā)酵調(diào)控，為降低γ-PGA作為保水劑產(chǎn)品的投入，并為罐上發(fā)酵提供數(shù)據(jù)參考.

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(責(zé)任編輯：朱秀英)

Screeningofaγ-Polyglutamicacidstrainanditsculturemediumoptimization

LI Pei-pei, ZHANG Wan-xu, WANG Qiang, TAN Jin-fang, HAN Yan-lai

(College of Resource and Environmental Sciences, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China)

In order to produce γ-Polyglutamic acid ( γ-PGA), a γ-PGA strain was isolated from preserved beancurd．The strain was identified asBacillussubtilisthrough morphological identification and 16Sr DNA sequencing analysis．γ-PGA qualitative and strain resistance were analyzed, and the best medium for cell growth and γ-PGA yield were selected. Acid hydrolysis of the fermentation detected by High Performance Liquid Chromatography (HPLC) showed that glutamate was the single production, and there was no significant change of the growth curve of the strain after cryopreservation for 3 months. Medium selection was investigated in the shake culture, and the results showed that medium A was best for cell growth and medium C rich in sodium glutamate was best for γ-PGA fermentation with the highest production of 28.9 g·L-1.

a γ-Polyglutamic acid strain; medium; growth curve; production

Q 939.9

：A

2013-11-05

河南省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(132102110038)；河南省教育廳自然科學(xué)基金項(xiàng)目(13A210496)；“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計(jì)劃(2012BAD05B0207)

李培培，1982年生，女，河南開封人，講師，博士，主要從事資源微生物方面的研究.

韓燕來,1965年生，女，河南駐馬店人，教授，碩士研究生導(dǎo)師.

1000-2340(2014)05-0631-06