朱向榮，李高陽，單 楊

（1.湖南省食品測(cè)試分析中心，湖南 長(zhǎng)沙410125；2.中南大學(xué)研究生院隆平分院，湖南 長(zhǎng)沙410125）

水稻是我國(guó)最重要的糧食作物，稻米品質(zhì)的優(yōu)劣直接影響人們的健康水平。鎘（cadm ium，Cd）是自然界中廣泛存在的重金屬元素，對(duì)人體具有較強(qiáng)的毒性。近年來，隨著我國(guó)有色金屬冶煉、采礦業(yè)與制造業(yè)的快速發(fā)展，化肥等農(nóng)用化學(xué)品的大量使用，農(nóng)田土壤重金屬污染尤其是鎘污染日趨嚴(yán)重[1]。水稻被認(rèn)為是鎘吸收最強(qiáng)的大宗谷類作物[2]。稻田鎘污染不僅導(dǎo)致水稻產(chǎn)量下降，更嚴(yán)重的是鎘元素在水稻植株內(nèi)大量累積，通過土壤—植物—人體的食物鏈途徑傳遞，嚴(yán)重威脅到人類健康，直接影響我國(guó)的糧食安全[3]。

世界各國(guó)或組織已經(jīng)對(duì)稻米中的鎘含量制定了嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn)。世界衛(wèi)生組織與聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織聯(lián)合下屬的食品法典委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)、日本的厚生省規(guī)定稻米中鎘的最高限量為0.4mg/kg，而歐盟委員會(huì)No.1881/2006指令與我國(guó)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)[4]規(guī)定稻米中鎘的最高限量為0.2 mg/kg。因此，采用快速、無損的方法檢測(cè)稻米鎘含量對(duì)控制稻米鎘含量以及保障稻米食用安全顯得尤為重要。

目前，火焰原子吸收光譜法（FAAS）、石墨爐原子吸收光譜法（GF-AAS），電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜（ICP-AES）和電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）等分析方法被廣泛用于農(nóng)產(chǎn)品（食品）中重金屬元素含量的測(cè)定。這些方法雖然靈敏度高、準(zhǔn)確性好，但也存在著儀器需要專業(yè)人員操作、繁雜的樣品前處理以及消耗大量的強(qiáng)酸試劑等缺點(diǎn)。中紅外（Mid-infrared spectroscopy，MIR）作為一種分子光譜分析手段，具有快速、便捷、非破壞性等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)廣泛用于土壤中成分的測(cè)定。國(guó)外的MIR研究主要集中在C和N這兩類營(yíng)養(yǎng)元素的含量測(cè)定上[5-6]，針對(duì)重金屬污染元素研究較少，例如：Siebielec、Philippe、Kumagai、鄔登巍等[7-10]采用中紅外漫反射光譜預(yù)測(cè)土壤重金屬元素含量。而采用MIR光譜測(cè)定植株中的重金屬含量特別是測(cè)定稻米中的鎘含量還未見相關(guān)報(bào)道。研究采用MIR光譜結(jié)合模式識(shí)別技術(shù)用于稻米鎘含量的定性預(yù)測(cè)，并對(duì)不同的光譜預(yù)處理手段進(jìn)行優(yōu)化，以期為稻米鎘的初篩和檢測(cè)提供了快速、無損的檢測(cè)手段。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品采集 在湖南省長(zhǎng)沙縣北山鎮(zhèn)收集了120個(gè)稻米樣本，經(jīng)烘干、去殼、粉碎、過篩，用于光譜測(cè)定以及重金屬鎘含量的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定。

1.1.2 儀器與試劑 試驗(yàn)儀器主要有石墨爐原子吸收光譜儀（AA-6800，日本島津公司）、MIR光譜儀器（AVATAR 360FT-IR，美國(guó)熱電尼高利公司）；試驗(yàn)用鎘標(biāo)準(zhǔn)貯備液（1 000mg/L）、大米粉中鎘成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GBW08511）（0.504mg/L）均由國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 鎘含量的測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)方法 采用GB/T 5009/15-2003標(biāo)準(zhǔn)[11]進(jìn)行測(cè)定。準(zhǔn)確稱量0.5g樣品，置于250m L的錐形瓶中，加入20m L的硝酸，采用沙浴加熱進(jìn)行消化，加熱至錐形瓶中的溶液變澄清停止加熱，冷卻后，用去離子水溶解并定容至25m L的容量瓶中，待上機(jī)。每批均采用含鎘稻米標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行質(zhì)控，并以空白樣品（僅試劑）消除背景。

1.2.2 MIR光譜測(cè)試 取一定量試樣在瑪瑙研缽中磨細(xì)后，加適量已干燥磨細(xì)的溴化鉀粉末，試樣與溴化鉀質(zhì)量比約為1︰100，充分混合并研磨；將研磨好的混合物均勻地放入模具的頂模與底模之間，然后把模具放入壓力機(jī)中，在12Pa左右的壓力下處理1～2min即可得到透明或均勻半透明的錠片；將錠片放入儀器支架中測(cè)量，保存數(shù)據(jù)。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)分析與模型評(píng)價(jià) 采用偏最小二乘識(shí)別分析法（PLS-DA）進(jìn)行模式識(shí)別，各計(jì)算程序均自行編寫，采用MATLAB軟件工具計(jì)算，采用預(yù)測(cè)集的分類正確率定性模型進(jìn)行評(píng)價(jià)。

2 結(jié)果與分析

2.1 校正集的選擇

對(duì)MIR光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行建模，選擇有代表性的訓(xùn)練集，不但可以減少建模的工作量，而且直接影響所建模型的適用性和準(zhǔn)確性。該研究共120個(gè)樣本，通過Kennard-Stone法[12]依次挑選出84個(gè)樣品作為校正集（calibration set），余下的36個(gè)樣品作為預(yù)測(cè)集（prediction set）。

2.2 光譜分析

圖1為代表性樣本的光譜圖，記錄了4 000 cm-1～400 cm-1波數(shù)樣品的MIR透反射光譜吸收情況。圖中3 000 cm-1附近的吸收峰為O-H鍵的伸縮振動(dòng)，1 600 cm-1為C=O的伸縮振動(dòng)，1 520 cm-1為N-H的面內(nèi)彎曲振動(dòng)，1430 cm-1的吸收峰為CH3的面內(nèi)彎曲振動(dòng)，1 350 cm-1附近的吸收峰為C-N的伸縮振動(dòng)吸收，1 150 cm-1附近為糖類的C-O與C-C的伸縮振動(dòng)，945 cm-1與887 cm-1為糖環(huán)的環(huán)振動(dòng)，825 cm-1的吸收峰為CH2變形振動(dòng)，756 cm-1附近的吸收峰為C-C骨架。上述基團(tuán)的吸收構(gòu)成了稻米中淀粉與蛋白質(zhì)在MIR光譜的主要吸收帶。而重金屬鎘就是以與淀粉或蛋白質(zhì)形成絡(luò)合物的形式存在，從而在MIR譜帶有吸收，這是采用MIR光譜檢測(cè)鎘元素的理論基礎(chǔ)。

圖1 樣本的原始MIR光譜圖Fig.1 The original MIR spectra of samples

2.3 PLS-DA識(shí)別分析

以《食品中污染物限量》（GB2762-2012）標(biāo)準(zhǔn)中的鎘限量為0.2mg/kg為分類閾值。將數(shù)據(jù)集鎘含量達(dá)標(biāo)（W%≤0.2mg/kg）的稻米樣本類標(biāo)定為-1，鎘含量超標(biāo)（W%＞0.2mg/kg）的稻米樣本定為＋1，以全譜作為輸入變量，光譜數(shù)據(jù)采用平滑，二階導(dǎo)數(shù)和自歸一化處理。PLS-DA是一種有教師監(jiān)督的模式識(shí)別方法，其判別能力比主成分分析（partial componentsanalysis，PCA）強(qiáng)。因此，該研究采用PLS-DA建立稻米中鎘是否合格的定性分類模型。采用10折法（10-fold）交叉驗(yàn)證選擇最佳主成分?jǐn)?shù)。由表1可知，36個(gè)預(yù)測(cè)集樣本中，30個(gè)樣本的屬性預(yù)測(cè)值與其真實(shí)屬性相符，預(yù)測(cè)正確；4、14、28、32、35和36號(hào)6個(gè)樣本的屬性預(yù)測(cè)值與實(shí)際值不符，預(yù)測(cè)錯(cuò)誤。準(zhǔn)確率達(dá)到83.3%。而且從上述6個(gè)預(yù)測(cè)錯(cuò)誤的樣本信息可以看出，4、28和32號(hào)樣本的鎘含量分別為0.221、0.218和0.243mg/kg，含量均在0.2mg/kg左右，接近閾值。這表明PLS-DA模型易識(shí)別錯(cuò)誤。

2.4 光譜預(yù)處理比較

采集的MIR光譜中，光程變化和光散射等因素將對(duì)建模的準(zhǔn)確性產(chǎn)生重要影響。因此，在全譜范圍內(nèi)，該研究考察了平滑（Smoothing）、一階導(dǎo)數(shù)（Firstderivative，1stDer）、二階導(dǎo)數(shù)（Second derivative，2nd Der）、中心化（centering）、自歸一化（autoscaling）及pareto歸一化等9種數(shù)據(jù)預(yù)處理方法的分類效果。表2為9種光譜預(yù)處理方法分類建模結(jié)果比較，采用訓(xùn)練集交叉驗(yàn)證準(zhǔn)確率與預(yù)測(cè)集的準(zhǔn)確率進(jìn)行評(píng)價(jià)。從表2中可以看出，通過導(dǎo)數(shù)處理，預(yù)測(cè)集鑒別準(zhǔn)確率明顯好于未進(jìn)行導(dǎo)數(shù)處理的結(jié)果，導(dǎo)數(shù)運(yùn)算可以去除斜坡背景以及基線偏移影響。

表1 驗(yàn)證集樣本的預(yù)測(cè)結(jié)果Table1 The prediction resultsof validation setsamples

表2 不同的光譜預(yù)處理方法對(duì)準(zhǔn)確率的影響Table 2 Effect of spectroscopy pretreatment methods on theaccuracy

從圖2中可以看出，二階導(dǎo)數(shù)處理后的結(jié)果比一階導(dǎo)數(shù)處理的結(jié)果要好，主要是由于導(dǎo)數(shù)運(yùn)算次數(shù)增加，將會(huì)提高光譜的信噪比。在三種歸一化手段中，自歸一化結(jié)果要比均值中心化與pareto歸一化要好，主要是由于MIR數(shù)據(jù)經(jīng)過自歸一化算法處理后，變量權(quán)重相同，均值為0，方差為1。上述處理能夠?qū)⒚總€(gè)變量對(duì)模型的影響平衡，賦予所有變量相同的權(quán)重，避免模型過擬和。因此，通過優(yōu)化，確定最佳的光譜預(yù)處理方法組合為平滑后，采用二階導(dǎo)數(shù)與自歸一化處理。

圖2 樣本的二階導(dǎo)數(shù)MIR光譜圖Table 2 Effect of spectroscopy pretreatment methods on theaccuracy

2.5 建模方法比較

為了比較建模的效果，還采用了K-最近鄰（k-nearestneighbor，KNN）法對(duì)稻米鎘MIR光譜數(shù)據(jù)集進(jìn)行定性分類。KNN算法中，K值的選擇將對(duì)KNN的分類效果產(chǎn)生重要影響。K值選擇過小或者過大，都將會(huì)導(dǎo)致放大噪聲數(shù)據(jù)的干擾，從而降低分類精度。以交叉驗(yàn)證錯(cuò)誤率為指標(biāo)，最終確定了K=10作為KNN模型的最優(yōu)值。采用KNN法，樣本的預(yù)測(cè)集準(zhǔn)確率為67.8%，預(yù)測(cè)集準(zhǔn)確率為75%，總準(zhǔn)確率為71.4%；而采用PLS-DA法，樣本的預(yù)測(cè)集準(zhǔn)確率為75%，預(yù)測(cè)集準(zhǔn)確率為83.3%，總準(zhǔn)確率為79.2%，其結(jié)果明顯優(yōu)于KNN法。原因可能是KNN屬于無參數(shù)方法，而PLS-DA屬于有參數(shù)調(diào)節(jié)方法；與KNN相比，PLS-DA法的收斂能力與全局尋優(yōu)能力要更強(qiáng)。

3 結(jié)論

該研究采用PLS-DA方法結(jié)合中紅外光譜技術(shù)，對(duì)稻米鎘進(jìn)行MIR光譜掃描，建立稻米鎘MIR定性識(shí)別模型，通過建模以及預(yù)測(cè)未知樣本，并優(yōu)化光譜預(yù)處理方法，最優(yōu)結(jié)果為：在全譜范圍內(nèi)，采用平滑、二階求導(dǎo)和自歸一化處理，得到PLS-DA模型校正集樣本的識(shí)別率為75.0%，預(yù)測(cè)集樣本的識(shí)別率為83.3%，總正確率為79.2%。該方法簡(jiǎn)單、快速、綠色環(huán)保，能夠用于稻米鎘含量是否超標(biāo)的定性初篩和檢測(cè)。后續(xù)研究將進(jìn)一步增加樣本數(shù)量，提高適用性，以確保模型的實(shí)際應(yīng)用效果。

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