葉子誠

摘要通過基因芯片技術(shù)，鑒定了一個PEG6000脅迫抑制表達基因。該基因編碼MYB轉(zhuǎn)錄因子，命名為OsSRMYB1。熒光定量PCR研究結(jié)果表明，該基因的表達顯著受PEG6000抑制，受氧化脅迫誘導，而低溫和ABA處理下該基因的表達未發(fā)生顯著變化。組織表達分析結(jié)果表明，OsSRMYB1基因在水稻不同組織中均有表達，在葉中表達量較高。在不同生長階段的穗中，OsSRMYB1基因在發(fā)育中的穗中表達較高，在成熟穗和幼穗中表達量較低。本研究為進一步深入分析OsSRMYB1的生物學功能提供參考。

關鍵詞MYB；水稻；滲透脅迫；穗發(fā)育；轉(zhuǎn)錄因子

中圖分類號S511文獻標識碼A文章編號 1007-5739（2014）11-0009-03

Cloning and Expression Analysis of a Osmotic Stress Repressive Gene in Rice

YE Zi-cheng

（College of Agriculture，Nanjing Agricultural University，Nanjing Jiangsu 210095）

AbstractA gene encoding MYB transcription factor was identified as a PEG6000-repressive gene by microarray，designated OsSRMYB1.Real-time RT-PCR assay suggested that expression of OsSRMYB1 was significantly repressed by PEG6000，while not markedly changed upon ABA or cold stress. OsSRMYB1 expression existed in the different tissues of rice and the expression was the highest in leaves. The tissue-specific expression of OsSRMYB1 indicated that it was highly expressed in the developing panicles. This study provide reference for the depth analysis of the biological functional of OsSRMYB1.

Key wordsMYB；rice；osmotic stress；panicle development；transcription factor

植物對非生物脅迫的適應依賴于一系列信號級聯(lián)反應的激活，包括脅迫信號的感知、信號轉(zhuǎn)導、脅迫相關基因的表達及脅迫相關代謝物的積累，從而對損傷進行修復，進而對細胞的穩(wěn)態(tài)進行重建。對脅迫相關基因編碼產(chǎn)物的類型和作用進行分類，主要有以下2種：一類是直接保護細胞免受逆境脅迫的功能蛋白，如LEA蛋白、抗凍蛋白、離子信道蛋白以及滲透調(diào)節(jié)因子；另外一類是一種調(diào)控蛋白，其可參與到脅迫信號的傳導和基因表達調(diào)節(jié)的過程中，包括轉(zhuǎn)錄因子、蛋白激酶等。已有研究表明，bZIP類、AP2/EREBP類、鋅指蛋白、MYB/MYC類等多種類型的轉(zhuǎn)錄因子參與到植物的非生物脅迫應答中。MYB類轉(zhuǎn)錄因子包含MYB結(jié)構(gòu)域，此結(jié)構(gòu)域最早是在脊椎動物原癌基因v-Myb編碼產(chǎn)物的DNA結(jié)合域中被發(fā)現(xiàn)[1]。YB轉(zhuǎn)錄因子一般定位于細胞核中，緊密地與核基質(zhì)和染色質(zhì)相連[2]。

根據(jù)MYB類轉(zhuǎn)錄因子所含有的MYB結(jié)構(gòu)域的數(shù)目，可被簡單地分成3個亞類[3]：一是只含1個MYB結(jié)構(gòu)的MYB蛋白亞類成員，二是含有2個MYB結(jié)構(gòu)域的R2R3亞類成員，三是含有3個MYB結(jié)構(gòu)域的R1R2R3亞類成員。以前有相關的研究表明，MYB類轉(zhuǎn)錄因子廣泛地在植物的各種反應中發(fā)生作用，包括細胞形態(tài)發(fā)生、次生代謝等。蔡新忠等[4]的研究結(jié)果證明MYB基因在番茄的抗旱中發(fā)揮一定的作用。Urao等[5]從擬南芥中分離出1個MYB基因Atmyb2，該基因的表達受到干旱、高鹽以及ABA等的誘導，體外EMSA表明Atmyb2蛋白能夠與MYB識別位點TAACTG進行特異性的結(jié)合。Abe等在分析一個足以響應干旱和ABA誘導的來源于rd22基因啟動子的67 bp DNA序列時，鑒定了2個順式作用元件，即MYC和MYB識別位點。瞬時表達分析表明Atmyb2能夠促進rd22啟動子驅(qū)動的報告基因的表達。Dene Kamp等[6]對擬南芥中MYB類轉(zhuǎn)錄因子AtMyb102的研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過NaCl和ABA處理后，與對照相比，AtMyb102的表達明顯要高，在受到ABA處理后，其在擬南芥的根、莖、葉、小花中的表達量會得到顯著的提高。通過基因芯片技術(shù)，筆者所在試驗室實定了1個PEG6000脅迫抑制表達的基因。該基因編碼MYB類轉(zhuǎn)錄因子，命名為OsSRMYB1。本研究將通過序列比對、結(jié)構(gòu)域分析、表達特性研究等手段分析明確OsSRMYB1在非生物脅迫中可能的功能，為進一步深入分析OsSRMYB1的生物學功能提供基礎。

1材料與方法

1.1植物材料及處理

水稻粳稻（Oryza sativa L.sub Japonica）品種韭菜青由筆者所在實驗室內(nèi)保存提供。水稻種子置于30 ℃環(huán)境中催芽2 d，將種子均勻地點播于96孔板中，于28 ℃培養(yǎng)箱中水培生長，條件為：光照16 h、黑暗8 h。營養(yǎng)液采用國際水稻所用的常規(guī)營養(yǎng)液配方[7]，待幼苗生長至3~4葉時，對幼苗按以下步驟處理：一是冷處理，將幼苗置于4 ℃環(huán)境中；二是模擬干旱處理，水稻幼苗營養(yǎng)液中加入20%的PEG6000；三是H2O2處理，水稻幼苗營養(yǎng)液中加入100 mmol/L H2O2；四是ABA處理，水稻幼苗營養(yǎng)液中加入0.05 mmol/L ABA。分時段（0、1、3、6、12、24、48 h）收集水稻幼苗地上部樣品，液氮速凍后于-80 ℃保存，用于RNA的提取。

1.2總RNA的提取

提取總RNA時，參照Invitrogen公司的Trizol試劑完成。在1%普通瓊脂糖凝膠電泳上將總RNA分離出來，經(jīng)過一定的分析，對總RNA的質(zhì)量以及濃度進行判斷。將符合要求的總RNA置于-80 ℃的環(huán)境條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3cDNA第一鏈的合成

參照MBI公司的反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)的操作手冊進行cDNA第一鏈的合成。取總RNA 2 μg置于DEPC-H2O中進行稀釋，總體積調(diào)至12 μL，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下于PCR擴增儀上保溫1 h，溫度控制在 42 ℃下即可；再在70 ℃下保溫10 min，最后置于-20 ℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4Quantitative Real-time PCR分析

以水稻18s rRNA作為內(nèi)參，進行實時熒光定量PCR試驗。20 μL PCR反應體系包括：10 μL 2× SYBR Green supermix reagent（包括反應緩沖液，dNTPs，SYBR Green染料），1.0 μL cDNA模板，20 nmol/L 基因特異引物，8 μL dd H2O。其中，用于該Real-time PCR分析的引物序列見表1。

1.5OsSRMYB1基因的生物信息學分析

參考Gramene數(shù)據(jù)庫中的OsSRMYB1基因序列信息（LOC_Os12g03150.1）[8]，根據(jù)Primer Premier 5對引物OsSR MYB1-F（5′-GAACTATAGCTAGCCAAGTAGCCATG-3′）及OsSRMYB1-R（5′-GTTCTTGATGTCGTTGTCGGTG-3′）進行設計，模板選擇水稻耐旱品種韭菜青cDNA，通過PCR對 OsSRMYB1基因的全長進行擴增，將其與pMD18-T載體進行連接并進行序列的測定。利用SMART網(wǎng)站（http：//smart.embl-heidelberg.de/）對獲得的序列進行蛋白序列結(jié)構(gòu)域進行分析。利用Rice oligonucleotide array database分析其在水稻不同組織中的表達。此外，利用genevestigator數(shù)據(jù)庫分析其在不同脅迫下的表達情況以及其共表達基因。運用ClustalX與MEGA 4軟件對OsSRMYB1進行多重序列比對與進化樹構(gòu)建。

2結(jié)果與分析

2.1OsSRMYB1的克隆及蛋白特性分析

以韭菜青cDNA為模板，通過PCR擴增獲得OsSRMYB1基因全長并進行測序及序列分析，結(jié)果表明OsSRMYB1的ORF長度為1 599 bp，蛋白產(chǎn)物由311個氨基酸構(gòu)成，分子量為34.06 KDa，等電點為-3.0。利用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）分析該蛋白的結(jié)構(gòu)域，結(jié)果表明該蛋白包含SANT結(jié)構(gòu)域（圖1），為MYB家族蛋白。

2.2OsSRMYB1與其他非生物脅迫相關MYB類鋅指蛋白的序列比對與進化樹構(gòu)建

選取非生物脅迫相關MYB類鋅指蛋白Atmyb102、Atmyb2、GmMYB92、GmMYB76和OsSRMYB1，利用ClustalX與MEGA4軟件進行序列比對及進化分析。由圖2、圖3可知，OsSRMYB1與其他4種MYB類鋅指蛋白的氨基酸序列顯著相似，特別是在其保守結(jié)構(gòu)域內(nèi)氨基酸序列高度保守。

2.3OsSRMYB1在不同組織及各種處理條件下的表達

利用Rice oligonucleotide array database，分析OsSRMYB1在水稻不同組織中的表達，結(jié)果分析表明OsSRMYB1基因在根、莖、葉片、葉鞘、穗等不同組織中均有表達（圖4），其在葉中表達水平較高。

利用Gene vestigator數(shù)據(jù)庫分析OsSRMYB1在不同脅迫下的表達情況，結(jié)果表明OsSRMYB1的表達受非生物脅迫影響，說明OsSRMYB1可能參與非生物脅迫響應。為了進一步分析OsSRMYB1在非生物脅迫中的功能，利用Real-time PCR分析了OsSRMYB11在H2O2、20% PEG、低溫（4 ℃）及ABA處理下的表達（圖5）。由表5可知，OsSRMYB1表達受H2O2誘導，而在20% PEG處理下其表達受抑制，表明OsSRMYB1可能參與了干旱、氧化脅迫等非生物脅迫的響應。

2.4OsSRMYB1的共表達與共調(diào)節(jié)基因分析

利用Genevestigator軟件對OsSRMYB1可能的共表達及共調(diào)節(jié)基因進行分析，結(jié)果如圖6、圖7所示。OsSRMYB1的共表達基因為LOC_Os09g37050，編碼RING-H2鋅指蛋白，根據(jù)genevestigator分析該基因受NAA、GA3誘導。OsSRMYB1的共調(diào)節(jié)基因為LOC_Os02g44320，編碼蛋白酶抑制劑蛋白，根據(jù)genevestigator分析該基因受冷害、H2O2誘導。

3結(jié)論與討論

現(xiàn)有的研究表明，水稻中有多個基因家族參與非生物脅迫的應答，如GT轉(zhuǎn)錄因子家族[9]、TIFY基因家族[10]、BURP基因家族[11]、類BRX基因家族[12]等。OsSRMYB1為MYB類鋅指蛋白，已有研究結(jié)果表明MYB類鋅指蛋白亦可能參與非生物脅迫響應，如大豆GmMYB92、GmMYB76 及擬南芥Atmyb102、Atmyb2蛋白。研究表明 OsSRMYB1是一種在細胞內(nèi)普遍存在且大量表達的多聚體核糖體蛋白質(zhì)，在基因表達、抗逆響應中起重要作用。在組織表達分析中OsSRMYB1在新葉與幼穗中含量較高，表明OsSRMYB1可能在主要在分生組織中表達。

本研究克隆了OsSRMYB1基因，并通過氨基酸序列比對、蛋白結(jié)構(gòu)域分析、基因表達特性等分析表明OsSRMYB1可能參與非生物脅迫響應，為進一步深入分析OsSRMYB1的生物學功能提供基礎。與大多數(shù)已經(jīng)報道的植物MYB類轉(zhuǎn)錄因子不同，本研究發(fā)現(xiàn)的OsSRMYB1受滲透脅迫的負調(diào)節(jié)，表明該基因可能在植物響應非生物脅迫過程中發(fā)揮了負向調(diào)控的作用。進一步將通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得過量和RNA干涉抑制表達OsSRMYB1基因的水稻轉(zhuǎn)基因植物，深入研究其參與的非生物脅迫應答機制。

4參考文獻

[1] 吳春霞.植物MYB基因研究進展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2009，37（20）：（下轉(zhuǎn)第13頁）

（上接第11頁）

9372-9374.

[2] 劉蕾，杜海，唐曉鳳，等.轉(zhuǎn)錄因子在植物抗逆脅迫中的作用及其分子機理[J].遺傳，2008，30（10）：1265-1271.

[3] 陳清湯，浩茹，董曉莉，等.植物Myb轉(zhuǎn)錄因子的研究進展[J].基因組學與應用生物學，2009，28（2）：365-372.

[4] 蔡新忠，徐幼平，樓健.番茄MYB基因片段的克隆及在過敏性反應時的表達[J].園藝學報，2003，30（5）：589-591.

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[12] LIU J，LIANG D，SONG Y，et al.Systematic identification and expression analysis of BREVISRADIX-like homologous genes in rice[J].Plant Sci，2009，178（2）：183-191.

1.5OsSRMYB1基因的生物信息學分析

參考Gramene數(shù)據(jù)庫中的OsSRMYB1基因序列信息（LOC_Os12g03150.1）[8]，根據(jù)Primer Premier 5對引物OsSR MYB1-F（5′-GAACTATAGCTAGCCAAGTAGCCATG-3′）及OsSRMYB1-R（5′-GTTCTTGATGTCGTTGTCGGTG-3′）進行設計，模板選擇水稻耐旱品種韭菜青cDNA，通過PCR對 OsSRMYB1基因的全長進行擴增，將其與pMD18-T載體進行連接并進行序列的測定。利用SMART網(wǎng)站（http：//smart.embl-heidelberg.de/）對獲得的序列進行蛋白序列結(jié)構(gòu)域進行分析。利用Rice oligonucleotide array database分析其在水稻不同組織中的表達。此外，利用genevestigator數(shù)據(jù)庫分析其在不同脅迫下的表達情況以及其共表達基因。運用ClustalX與MEGA 4軟件對OsSRMYB1進行多重序列比對與進化樹構(gòu)建。

2結(jié)果與分析

2.1OsSRMYB1的克隆及蛋白特性分析

以韭菜青cDNA為模板，通過PCR擴增獲得OsSRMYB1基因全長并進行測序及序列分析，結(jié)果表明OsSRMYB1的ORF長度為1 599 bp，蛋白產(chǎn)物由311個氨基酸構(gòu)成，分子量為34.06 KDa，等電點為-3.0。利用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）分析該蛋白的結(jié)構(gòu)域，結(jié)果表明該蛋白包含SANT結(jié)構(gòu)域（圖1），為MYB家族蛋白。

2.2OsSRMYB1與其他非生物脅迫相關MYB類鋅指蛋白的序列比對與進化樹構(gòu)建

選取非生物脅迫相關MYB類鋅指蛋白Atmyb102、Atmyb2、GmMYB92、GmMYB76和OsSRMYB1，利用ClustalX與MEGA4軟件進行序列比對及進化分析。由圖2、圖3可知，OsSRMYB1與其他4種MYB類鋅指蛋白的氨基酸序列顯著相似，特別是在其保守結(jié)構(gòu)域內(nèi)氨基酸序列高度保守。

2.3OsSRMYB1在不同組織及各種處理條件下的表達

利用Rice oligonucleotide array database，分析OsSRMYB1在水稻不同組織中的表達，結(jié)果分析表明OsSRMYB1基因在根、莖、葉片、葉鞘、穗等不同組織中均有表達（圖4），其在葉中表達水平較高。

利用Gene vestigator數(shù)據(jù)庫分析OsSRMYB1在不同脅迫下的表達情況，結(jié)果表明OsSRMYB1的表達受非生物脅迫影響，說明OsSRMYB1可能參與非生物脅迫響應。為了進一步分析OsSRMYB1在非生物脅迫中的功能，利用Real-time PCR分析了OsSRMYB11在H2O2、20% PEG、低溫（4 ℃）及ABA處理下的表達（圖5）。由表5可知，OsSRMYB1表達受H2O2誘導，而在20% PEG處理下其表達受抑制，表明OsSRMYB1可能參與了干旱、氧化脅迫等非生物脅迫的響應。

2.4OsSRMYB1的共表達與共調(diào)節(jié)基因分析

利用Genevestigator軟件對OsSRMYB1可能的共表達及共調(diào)節(jié)基因進行分析，結(jié)果如圖6、圖7所示。OsSRMYB1的共表達基因為LOC_Os09g37050，編碼RING-H2鋅指蛋白，根據(jù)genevestigator分析該基因受NAA、GA3誘導。OsSRMYB1的共調(diào)節(jié)基因為LOC_Os02g44320，編碼蛋白酶抑制劑蛋白，根據(jù)genevestigator分析該基因受冷害、H2O2誘導。

3結(jié)論與討論

現(xiàn)有的研究表明，水稻中有多個基因家族參與非生物脅迫的應答，如GT轉(zhuǎn)錄因子家族[9]、TIFY基因家族[10]、BURP基因家族[11]、類BRX基因家族[12]等。OsSRMYB1為MYB類鋅指蛋白，已有研究結(jié)果表明MYB類鋅指蛋白亦可能參與非生物脅迫響應，如大豆GmMYB92、GmMYB76 及擬南芥Atmyb102、Atmyb2蛋白。研究表明 OsSRMYB1是一種在細胞內(nèi)普遍存在且大量表達的多聚體核糖體蛋白質(zhì)，在基因表達、抗逆響應中起重要作用。在組織表達分析中OsSRMYB1在新葉與幼穗中含量較高，表明OsSRMYB1可能在主要在分生組織中表達。

本研究克隆了OsSRMYB1基因，并通過氨基酸序列比對、蛋白結(jié)構(gòu)域分析、基因表達特性等分析表明OsSRMYB1可能參與非生物脅迫響應，為進一步深入分析OsSRMYB1的生物學功能提供基礎。與大多數(shù)已經(jīng)報道的植物MYB類轉(zhuǎn)錄因子不同，本研究發(fā)現(xiàn)的OsSRMYB1受滲透脅迫的負調(diào)節(jié)，表明該基因可能在植物響應非生物脅迫過程中發(fā)揮了負向調(diào)控的作用。進一步將通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得過量和RNA干涉抑制表達OsSRMYB1基因的水稻轉(zhuǎn)基因植物，深入研究其參與的非生物脅迫應答機制。

4參考文獻

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1.5OsSRMYB1基因的生物信息學分析

參考Gramene數(shù)據(jù)庫中的OsSRMYB1基因序列信息（LOC_Os12g03150.1）[8]，根據(jù)Primer Premier 5對引物OsSR MYB1-F（5′-GAACTATAGCTAGCCAAGTAGCCATG-3′）及OsSRMYB1-R（5′-GTTCTTGATGTCGTTGTCGGTG-3′）進行設計，模板選擇水稻耐旱品種韭菜青cDNA，通過PCR對 OsSRMYB1基因的全長進行擴增，將其與pMD18-T載體進行連接并進行序列的測定。利用SMART網(wǎng)站（http：//smart.embl-heidelberg.de/）對獲得的序列進行蛋白序列結(jié)構(gòu)域進行分析。利用Rice oligonucleotide array database分析其在水稻不同組織中的表達。此外，利用genevestigator數(shù)據(jù)庫分析其在不同脅迫下的表達情況以及其共表達基因。運用ClustalX與MEGA 4軟件對OsSRMYB1進行多重序列比對與進化樹構(gòu)建。

2結(jié)果與分析

2.1OsSRMYB1的克隆及蛋白特性分析

以韭菜青cDNA為模板，通過PCR擴增獲得OsSRMYB1基因全長并進行測序及序列分析，結(jié)果表明OsSRMYB1的ORF長度為1 599 bp，蛋白產(chǎn)物由311個氨基酸構(gòu)成，分子量為34.06 KDa，等電點為-3.0。利用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）分析該蛋白的結(jié)構(gòu)域，結(jié)果表明該蛋白包含SANT結(jié)構(gòu)域（圖1），為MYB家族蛋白。

2.2OsSRMYB1與其他非生物脅迫相關MYB類鋅指蛋白的序列比對與進化樹構(gòu)建

選取非生物脅迫相關MYB類鋅指蛋白Atmyb102、Atmyb2、GmMYB92、GmMYB76和OsSRMYB1，利用ClustalX與MEGA4軟件進行序列比對及進化分析。由圖2、圖3可知，OsSRMYB1與其他4種MYB類鋅指蛋白的氨基酸序列顯著相似，特別是在其保守結(jié)構(gòu)域內(nèi)氨基酸序列高度保守。

2.3OsSRMYB1在不同組織及各種處理條件下的表達

利用Rice oligonucleotide array database，分析OsSRMYB1在水稻不同組織中的表達，結(jié)果分析表明OsSRMYB1基因在根、莖、葉片、葉鞘、穗等不同組織中均有表達（圖4），其在葉中表達水平較高。

利用Gene vestigator數(shù)據(jù)庫分析OsSRMYB1在不同脅迫下的表達情況，結(jié)果表明OsSRMYB1的表達受非生物脅迫影響，說明OsSRMYB1可能參與非生物脅迫響應。為了進一步分析OsSRMYB1在非生物脅迫中的功能，利用Real-time PCR分析了OsSRMYB11在H2O2、20% PEG、低溫（4 ℃）及ABA處理下的表達（圖5）。由表5可知，OsSRMYB1表達受H2O2誘導，而在20% PEG處理下其表達受抑制，表明OsSRMYB1可能參與了干旱、氧化脅迫等非生物脅迫的響應。

2.4OsSRMYB1的共表達與共調(diào)節(jié)基因分析

利用Genevestigator軟件對OsSRMYB1可能的共表達及共調(diào)節(jié)基因進行分析，結(jié)果如圖6、圖7所示。OsSRMYB1的共表達基因為LOC_Os09g37050，編碼RING-H2鋅指蛋白，根據(jù)genevestigator分析該基因受NAA、GA3誘導。OsSRMYB1的共調(diào)節(jié)基因為LOC_Os02g44320，編碼蛋白酶抑制劑蛋白，根據(jù)genevestigator分析該基因受冷害、H2O2誘導。

3結(jié)論與討論

現(xiàn)有的研究表明，水稻中有多個基因家族參與非生物脅迫的應答，如GT轉(zhuǎn)錄因子家族[9]、TIFY基因家族[10]、BURP基因家族[11]、類BRX基因家族[12]等。OsSRMYB1為MYB類鋅指蛋白，已有研究結(jié)果表明MYB類鋅指蛋白亦可能參與非生物脅迫響應，如大豆GmMYB92、GmMYB76 及擬南芥Atmyb102、Atmyb2蛋白。研究表明 OsSRMYB1是一種在細胞內(nèi)普遍存在且大量表達的多聚體核糖體蛋白質(zhì)，在基因表達、抗逆響應中起重要作用。在組織表達分析中OsSRMYB1在新葉與幼穗中含量較高，表明OsSRMYB1可能在主要在分生組織中表達。

本研究克隆了OsSRMYB1基因，并通過氨基酸序列比對、蛋白結(jié)構(gòu)域分析、基因表達特性等分析表明OsSRMYB1可能參與非生物脅迫響應，為進一步深入分析OsSRMYB1的生物學功能提供基礎。與大多數(shù)已經(jīng)報道的植物MYB類轉(zhuǎn)錄因子不同，本研究發(fā)現(xiàn)的OsSRMYB1受滲透脅迫的負調(diào)節(jié)，表明該基因可能在植物響應非生物脅迫過程中發(fā)揮了負向調(diào)控的作用。進一步將通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得過量和RNA干涉抑制表達OsSRMYB1基因的水稻轉(zhuǎn)基因植物，深入研究其參與的非生物脅迫應答機制。

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