秀 花，趙萌莉，韓 冰，參木友，拉 巴

(1.西藏農(nóng)牧科學(xué)院草業(yè)科學(xué)研究所，西藏 拉薩市 850009； 2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生態(tài)環(huán)境學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特市 010019)

放牧脅迫下冰草種群遺傳多樣性的研究

秀 花1，趙萌莉2，韓 冰2，參木友1，拉 巴1

(1.西藏農(nóng)牧科學(xué)院草業(yè)科學(xué)研究所，西藏 拉薩市 850009； 2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生態(tài)環(huán)境學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特市 010019)

本研究采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對放牧脅迫下冰草的遺傳多樣性進(jìn)行了研究。由Shannon’s和Nei’多樣性指數(shù)檢測的研究結(jié)果表明，雖然放牧脅迫導(dǎo)致部分位點(diǎn)丟失，但整個(gè)種群仍表現(xiàn)出豐富的多態(tài)性，ISSR檢測的多態(tài)性條帶比率為91.95%，種群間的遺傳差異很小，放牧脅迫并未使冰草種群產(chǎn)生遺傳分化。

冰草；ISSR；放牧脅迫；遺傳多樣性

引言

冰草屬(Agrop J.Gaertn)為禾本科早熟禾亞科大麥族小麥亞族植物。是一種放牧和打草兼用型牧草，并已廣泛馴化栽培作為草地補(bǔ)播草種。有關(guān)冰草遺傳多樣性方面的研究報(bào)道很多。閻貴興〔1〕(2001)發(fā)現(xiàn)冰草屬植物不同種間存在核型多型性；云錦鳳〔2〕(1990)對蒙古冰草B染色體進(jìn)行了分析；謝新民〔3〕(2001)對蒙古冰草遺傳多樣性研究結(jié)果表明，蒙古冰草種內(nèi)居群間及同一居群內(nèi)的不同個(gè)體間存在豐富的多樣性；李景欣〔4〕(2004)利用根尖壓片法，從細(xì)胞水平對來自6個(gè)不同居群的冰草的遺傳多樣性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，冰草種內(nèi)居群間存在一定程度的分化和變異，一些北美國家有關(guān)冰草的研究，主要側(cè)重其生態(tài)建設(shè)、耐牧性及營養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸和儲(chǔ)存等。

本文應(yīng)用ISSR分析技術(shù)對不同放牧梯度下的冰草遺傳多樣性及其分化進(jìn)行研究，并為探索合理的放牧制度和草地利用方式，防止草原退化和退化草原的恢復(fù)提供理論基礎(chǔ)，為篩選耐牧基因提供遺傳學(xué)信息。

1 材料和方法

在植物生長旺盛期按株采集冰草新鮮葉片。株距50m以上，選擇株叢徑中等、生長正常的植株30株，剪去葉片，用保鮮膜包好放入冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室，貯存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.1實(shí)驗(yàn)地自然概況

本實(shí)驗(yàn)選用的冰草取自內(nèi)蒙古錫林郭勒盟白音錫勒牧場中國科學(xué)院草地生態(tài)定位站，地處東經(jīng)：116°04′～117°05′，北緯：43°26′～44°08′，海拔高度：1250-1280m，屬溫帶草原區(qū)典型草原栗鈣土亞區(qū)。年均氣溫-0.4℃，1月平均氣溫為-23℃，7月平均氣溫為17.9℃，年降水量350mm，主要集中在6-8月，占年降水量的76.26%。在研究區(qū)域內(nèi)，選擇長期無放牧(圍封20年以上)和放牧樣地，三次重復(fù)。

1.2 DNA的提取與檢測

稱取0.25g新鮮葉片。采用CTAB法提取每個(gè)植株的總DNA，用0.7%的瓊脂糖電泳檢測DNA質(zhì)量，如圖1、圖2為冰草的部分樣品DNA電泳結(jié)果，DNA的純度和濃度通過紫外吸收法測定。

1.3 ISSR反應(yīng)條件及程序

PCR反應(yīng)體系的建立主要通過對DNA濃度、引物等條件進(jìn)行初步的調(diào)整，達(dá)到了反應(yīng)條件的優(yōu)化，確定了ISSR擴(kuò)增反應(yīng)總體積為25ul,反應(yīng)體系:其中包括10*buffer 2.5ul,2.0mmol/LMgcl22ul,0.1mmol/LdNTPs 0.4ul,0.15mmol/LISSR引物1ul,40ng左右的基因組DNA,1單位TapDNA聚合酶。以上各種加完后用滅菌三蒸水補(bǔ)齊至25ul。

擴(kuò)增在PE9600型PCR儀上進(jìn)行。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5min,94℃變性45s,54℃退火1min,72℃延伸1.5min,進(jìn)行44個(gè)循環(huán),最后72℃補(bǔ)平5min,4℃停止。擴(kuò)增產(chǎn)物用2.8%瓊脂糖凝膠(內(nèi)含溴化乙錠)電泳鑒定，電泳1.5-2.0小時(shí)后，將凝膠放在自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)下進(jìn)行分析。

1.4引物篩選

以無放牧樣地的冰草DNA為材料，對30個(gè)ISSR引物進(jìn)行篩選，篩選出12個(gè)擴(kuò)增條帶較多、信號(hào)強(qiáng)、背景清晰的引物用于ISSR-PCR反應(yīng)。引物由上海生物工程公司合成，名稱和序列見表1。

表1 ISSR所用引物序列與序號(hào)

1.5擴(kuò)增產(chǎn)物和差異帶的分析方法

1.5.1 帶的記錄

電泳圖的每一條帶(DNA片段)，均為一個(gè)分子標(biāo)記(Marker)，代表一個(gè)引物的結(jié)合位點(diǎn)。根據(jù)各分子標(biāo)記的遷移率及其有無統(tǒng)計(jì)所有的二元數(shù)據(jù)；有帶(顯性)記作1，無帶(隱性)記作0，強(qiáng)帶和弱帶的賦值均為1。

1.5.2 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析法

應(yīng)用POPGEN32軟件對冰草種間遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，計(jì)算Nei基因多樣性指數(shù)(H)，Shannon表型信息指數(shù)(I)，群體分化系數(shù)(Gst)等；根據(jù)Nei遺傳距離用類平均聚類方法(UPGMA)進(jìn)行系統(tǒng)聚類，分析群體間遺傳分化關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1遺傳多態(tài)性分析

本實(shí)驗(yàn)中，PCR反應(yīng)擴(kuò)增出的DNA片斷大小在200-1500bp之間，各引物檢測出的位點(diǎn)總數(shù)和單態(tài)位點(diǎn)及多態(tài)位點(diǎn)不同(表2)，其中22893引物檢測出的位點(diǎn)數(shù)最多，為12個(gè)，36542引物檢測出位點(diǎn)數(shù)最少，為4個(gè)。12個(gè)ISSR引物在22份材料間共擴(kuò)增出87個(gè)位點(diǎn)，平均每條引物產(chǎn)生7.25條帶，在87個(gè)位點(diǎn)中有80個(gè)為多態(tài)位點(diǎn)，多態(tài)位點(diǎn)比率為91.95%。不同引物多態(tài)位點(diǎn)從1-12個(gè)，多態(tài)位點(diǎn)比率從50%到100%。其中無放牧冰草種群多態(tài)位點(diǎn)比率為77.01%，放牧冰草種群為60.92%(表3)。

表2 各引物擴(kuò)增的位點(diǎn)數(shù)及多態(tài)位點(diǎn)數(shù)

表3 冰草種群的多態(tài)位點(diǎn)比較

2.2基因頻率

用ISSR分析無放牧與放牧冰草種群的基因頻率變化，經(jīng)G2檢驗(yàn)，在引物31673擴(kuò)增的1200bp位點(diǎn)，引物22893擴(kuò)增的1000bp、1500bp，引物22894的450bp、550bp、750bp，引物31675的550bp，引物31676的520bp，引物31672的900bp，引物36542的900bp，引物36543的200bp、350bp位點(diǎn)上兩個(gè)種群的基因頻率變化表現(xiàn)出極顯著性(p<0.001)，在引物22894擴(kuò)增的1000bp位點(diǎn)、引物31676的420bp、引物31669的700bp、引物31672的1000bp、引物36542的900bp、引物36543的800bp位點(diǎn)均為顯著(p<0.01)。在引物22894擴(kuò)增的450bp、550bp位點(diǎn)，引物36543的200bp位點(diǎn)上無放牧種群基因頻率均為1，放牧種群基因頻率均為0。而引物31676擴(kuò)增的520bp位點(diǎn)上無放牧種群的基因頻率為0，放牧種群的基因頻率為1?？梢姺拍撩{迫不僅使冰草種群的基因頻率發(fā)生了變化,與無放牧種群相比，放牧種群部分位點(diǎn)缺失，但也有的位點(diǎn)只在放牧種群中出現(xiàn)。

2.3遺傳多樣性分析

根據(jù)表4，引物31669估算的種群內(nèi)遺傳多樣性(Hpop)最高(0.53)，引物31676估算的種群內(nèi)遺傳多樣性最小(0.21)，12個(gè)引物估算的種群內(nèi)遺傳多樣性平均值是0.33；對種內(nèi)總的遺傳多樣性(Hsp)的估算，引物31669估算數(shù)值最高(0.58)，引物36541估算數(shù)值最低(0.30)，平均值為0.44。由Shannon，s指數(shù)估計(jì)的種群內(nèi)遺傳多樣性在引物31669中最大為91.18%，引物22894最小44.92%，種群內(nèi)遺傳多樣性的平均值為75.87%。種群間遺傳多樣性幅度從8.82%(引物31669)到55.08%(引物22894)，種群間遺傳分化的平均值為24.13%，說明放牧脅迫對冰草種群的分化程度有影響，由于2個(gè)冰草種群所處的地理自然環(huán)境相同，種群之間并未產(chǎn)生隔離，仍存在基因交流，因而沒有哪個(gè)種群擁有特有的位點(diǎn)或等位基因。但是，并非所有等位基因在不同種群均有分布，有的位點(diǎn)在不同的種群上有丟失現(xiàn)象。

表4 Shannon’s多樣性指數(shù)估計(jì)的冰草種群內(nèi)、種群間遺傳多樣性及分化

2.4遺傳結(jié)構(gòu)與基因流

Nei(表8)’指數(shù)計(jì)算的冰草種群內(nèi)遺傳多樣性平均值是0.22，種內(nèi)總遺傳多樣性的平均值為0.29，種群間的遺傳分化為23.66%，說明有23.66%的遺傳變異存在于種群間，大部分遺傳變異存在于種群內(nèi)(76.34%)，但不同引物所占的比率不同，其中引物22894最高為57.62%，而引物31669最低僅為9.55%。

表5中，各個(gè)引物的Nm值從4.74(引物31669)到0.37(引物22894)不等，平均值為1.61。Wrigst(1951)認(rèn)為〔5〕，當(dāng)Nm>1時(shí)，基因流可以防止遺傳漂變引起的居群間的遺傳分化，如果Nm<1則由于遺傳漂變可以導(dǎo)致種群間明顯的遺傳分化。因此，當(dāng)Nm值生高時(shí)，Gst值就降低。無放牧與放牧冰草種群的基因流的存在說明種群間有基因的交流，且遺傳分化不是由遺傳漂變產(chǎn)生的，通過對冰草種群生長環(huán)境的分析研究，冰草種群相似的基因頻率可能是由于相同的生境選擇壓力所引起的。

表5 Nei，指數(shù)估計(jì)的冰草種群內(nèi)、種群間遺傳多樣性及分化

Nm=estimate of gene flow Gst or Gcs. E. g., Nm=0.5(1-Gst)/Gst

2.5遺傳距離與遺傳相似度分析

遺傳距離和遺傳相似度是評(píng)價(jià)種群內(nèi)和種群間遺傳變異水平的重要指標(biāo)。根據(jù)12個(gè)引物ISSR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果，按Nei的方法計(jì)算出無放牧與放牧冰草種群的遺傳距離和遺傳相似度。遺傳距離越大，親緣關(guān)系越遠(yuǎn)；遺傳相似度越大，親緣關(guān)系越近。無放牧冰草種群和放牧冰草種群遺傳距離為0.18；遺傳相似度為0.83。

3 討論與結(jié)論

本研究對無放牧冰草種群與放牧冰草種群進(jìn)行ISSR分析的結(jié)果，由Shannon’s多樣性指數(shù)估計(jì)的各個(gè)引物在2個(gè)冰草種群內(nèi)的遺傳多樣性顯示無放牧冰草種群大于放牧冰草種群，這與Nei’指數(shù)估計(jì)的遺傳多樣性結(jié)果一致，這說明放牧脅迫在一定程度上降低了冰草種群的遺傳多樣性。2個(gè)冰草種群總的種內(nèi)多態(tài)位點(diǎn)百分率為91.95%，高于高等植物平均遺傳多樣性水平為70%〔6〕。Grant和Millar等都認(rèn)為一個(gè)物種的進(jìn)化潛力和抵御不良環(huán)境的能力取決于遺傳多樣性水平的高低〔7、8〕。因此，冰草如此高的遺傳多樣性水平是其在放牧脅迫等不良環(huán)境條件下仍能夠生存的遺傳基礎(chǔ)。在放牧脅迫下，冰草種群ISSR擴(kuò)增的位點(diǎn)數(shù)下降，多態(tài)位點(diǎn)數(shù)也由無牧的67個(gè)下降到放牧的53個(gè)，同時(shí)隨著多態(tài)位點(diǎn)數(shù)的下降遺傳多樣性也明顯降低。

對無放牧冰草種群和放牧冰草種群進(jìn)行ISSR分析的結(jié)果，放牧脅迫下冰草種群的部分位點(diǎn)丟失，但也有新的位點(diǎn)出現(xiàn)。由Shannon’s和Nei’多樣性指數(shù)檢測的遺傳多樣性，無放牧冰草種群大于放牧冰草種群，而且無放牧冰草種群的多態(tài)位點(diǎn)比率也大于放牧冰草種群，這說明放牧脅迫使冰草種群的遺傳多樣性降低，但無放牧與放牧冰草種群多態(tài)位點(diǎn)比率分別為77.01%和60.92%，種內(nèi)總多態(tài)位點(diǎn)比率為91.95%，可見基因組仍表現(xiàn)出豐富的多態(tài)性。

〔1〕閻貴興.中國草地飼用植物染色體研究.呼和浩特：內(nèi)蒙古人民出版社，2001

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附圖

冰草種群ISSR擴(kuò)增圖版

S543+.9

A

2095—5952(2014)01—0030—06

2013-10-22

秀 花(1977-)，女，蒙古族，助理研究員，從事草地生態(tài)和管理研究工作。