代文婷 鄭 楠 趙圣國 王加啟*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部奶產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)室，北京 100193;2.吉林大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，長春 130062;3.農(nóng)業(yè)部奶及奶制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心，北京 100193;4.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

反芻動(dòng)物瘤胃細(xì)菌的數(shù)量和種類最多，根據(jù)細(xì)菌的定植部位可分為3類:瘤胃液相細(xì)菌、瘤胃固相細(xì)菌和瘤胃壁黏附細(xì)菌。20世紀(jì)，研究人員主要借助顯微鏡檢和分離培養(yǎng)法對瘤胃壁黏附細(xì)菌進(jìn)行研究，分離出了一些尿素分解菌、蛋白降解菌及纖維素分解菌等，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)瘤胃壁黏附細(xì)菌在氧自由基的清除［1］、尿素降解［1］、組織循環(huán)［2］及上皮屏障［3］等方面起到重要作用。由于瘤胃中大于90%的細(xì)菌無法分離培養(yǎng)，因此，純培養(yǎng)方法限制了對瘤胃壁細(xì)菌的研究，尤其是細(xì)菌群落的多樣性和功能。近些年來，分子生物學(xué)方法，如變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)、限制片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)、16S rDNA 文庫和高通量測序等被廣泛地應(yīng)用在瘤胃微生物研究中，豐富了對瘤胃微生物的種類和多樣性等方面的認(rèn)識，也推動(dòng)了對瘤胃壁黏附細(xì)菌的深入研究。本文主要從瘤胃壁黏附細(xì)菌的多樣性、影響因素和功能3個(gè)方面對其研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 瘤胃壁黏附細(xì)菌多樣性

1.1 基于純培養(yǎng)方法分離的瘤胃壁黏附細(xì)菌

20世紀(jì)，研究人員主要通過純培養(yǎng)法研究瘤胃壁黏附細(xì)菌，所分離出的菌株見表1。瘤胃壁黏附細(xì)菌多為桿菌、球菌等。純培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)瘤胃壁黏附菌群在瘤胃里的比例較低，占總菌數(shù)的1% ～2%［4］。

1990 年，Semjén 等［5］從瘤胃壁分離出 1 株很常見的尿素降解菌，為革蘭氏陽性球菌，占瘤胃壁黏附菌群總數(shù)的11.7% ～14.1%，推測它可能是葡萄球菌(Staphylococcus)或微球菌(Micrococcus)。同年 Semjén等［5］從公牛瘤胃壁中分離出2株牛鏈球菌(Streptococcus)和1株大腸桿菌(E.coli)。Styriak等［6］從犢牛瘤胃壁上分離出6株乳酸菌(Lactobacillus)和4株牛鏈球菌。

純培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)瘤胃黏附細(xì)菌與瘤胃內(nèi)容物細(xì)菌存在差異性。Cheng等［1］發(fā)現(xiàn)瘤胃壁黏附菌群與瘤胃內(nèi)容物菌群存在很大差異，如表1所示，其中丁酸弧菌屬(Butyrivibrio sp.)為瘤胃壁黏附細(xì)菌的優(yōu)勢菌之一，占到瘤胃壁黏附細(xì)菌總數(shù)的31.1%;擬桿菌屬(Bacteroides sp.)、反芻月形單胞菌屬(Selenomonas ruminantium)、溶糊精琥珀酸弧菌屬(Succinivibrio dextrinosolvens)和牛鏈球菌屬(Streptococcus)分別占瘤胃壁黏附細(xì)菌總數(shù)的22.4% 、9.9% 、8.7% 和 8.1% 。而 Semjén 等［5］和Styriak等［6］通過純培養(yǎng)分離法發(fā)現(xiàn)瘤胃壁黏附菌群與瘤胃內(nèi)容物菌群至少有90%相似，但是還存在一定差異。

表1 純培養(yǎng)所得到的瘤胃壁黏附菌與瘤胃內(nèi)容物菌群Table 1 Rumen epithelial adherent bacteria flora and rumen content bacteria flora based on isolation

1.2 基于未培養(yǎng)方法研究的瘤胃壁黏附細(xì)菌

瘤胃壁黏附細(xì)菌難以分離培養(yǎng)，因此人們試圖尋找新的方法來研究那些未培養(yǎng)的瘤胃壁黏附細(xì)菌。16S rDNA文庫和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)指紋圖譜法與高通量測序等為鑒定這些不能分離培養(yǎng)的細(xì)菌提供了技術(shù)支持。

Cho等［16］通過構(gòu)建16S rDNA文庫探究了瘤胃中不同生態(tài)位(瘤胃固相、瘤胃液相及瘤胃壁)中各細(xì)菌的分布狀況，見表2。Sadet-Bourgeteau等［11］利用PCR-DGGE指紋圖譜發(fā)現(xiàn)公羊瘤胃壁黏附菌可歸為5個(gè)門，即厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)、密螺旋體門(Spirochaetes)和候選門(TM7)，其中厚壁菌門和擬桿菌門是其主要細(xì)菌群(占瘤胃壁黏附細(xì)菌總數(shù)的86%)，而變形菌門占瘤胃壁黏附細(xì)菌總數(shù)的13%，密螺旋體門和候選門TM7的含量均少于1%。通過該方法還發(fā)現(xiàn)了瘤胃壁黏附細(xì)菌中存在一些特殊的細(xì)菌——乳酸菌、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞(Stenotrophomonas maltophilia)、微球菌和梭酸菌，但是沒有檢測到尿素分解菌［14］。在瘤胃壁黏附細(xì)菌門級分類水平上，厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門及未知菌是肉牛瘤胃壁黏附菌群的主要細(xì)菌，見表 3。Petri等［15］通過 DGGE、定量PCR和16S rRNA測序法研究8頭犢牛的核心瘤胃壁黏附菌組成，如圖1。其中，最新鑒定的未培養(yǎng)瘤胃壁黏附細(xì)菌奇異菌屬(Atopobium)和歐氏菌屬(Olsenella)很可能早期研究中被錯(cuò)誤鑒定，形似微球菌(Micrococcus)、棒狀桿菌(Corynebacterium)和丙酸菌(Proponibacterium)。

此外，瘤胃壁與瘤胃內(nèi)容物細(xì)菌多樣性指數(shù)略有差異，公羊瘤胃壁黏附菌群的多樣性(Shannon指數(shù)=2.818)［10］略高于其瘤胃液相菌群的多樣性(Shannon 指數(shù) =2.546)［18］。

表2 16S r DNA指紋圖譜法分析3個(gè)不同瘤胃生態(tài)位中各細(xì)菌分布狀況Table 2 16S rDNA fingerprint method of bacterial diversity in 3 fractions of cow rumen［16］%

表3 瘤胃壁黏附菌與瘤胃內(nèi)容物菌群比較(門級水平)Table 3 Comparison between rumen epithelial adherent bacteria and bacteria of rumen concent bacteria flora(phylum level)［18］%

2 瘤胃壁黏附細(xì)菌多樣性的影響因素

2.1 飼糧

飼糧是影響瘤胃內(nèi)容物菌群結(jié)構(gòu)的主要因素之一［19］。然而飼糧是否也是影響瘤胃壁黏附菌群的主要因素，近些年來，人們對不同反芻動(dòng)物(牛和羊)的研究結(jié)果略有差異。飼糧精粗比能影響瘤胃微生物的多樣性，同樣也能影響瘤胃壁黏附細(xì)菌的多樣性。Sadet等［10］發(fā)現(xiàn)高精料和高粗料組動(dòng)物個(gè)體間的瘤胃壁黏附菌多樣性存在一定差異，但是不顯著。隨后Sadet-Bourgeteau等［11］發(fā)現(xiàn)高精料和高粗料組公羊瘤胃壁黏附菌的多樣性差異顯著。前后2次研究的結(jié)果截然不同，一方面是由于2次研究中飼糧組成和飼喂方式存在差異，另一方面可能是宿主對瘤胃壁黏附細(xì)菌的多樣性影響較大，掩蓋了飼糧效應(yīng)。

圖1 瘤胃壁核心黏附細(xì)菌［15］Fig.1 Rumen epithelial core adherent bacteira

然而Chen等［17］發(fā)現(xiàn):在不同精粗比飼糧轉(zhuǎn)換過程中，肉牛瘤胃壁黏附菌群的多樣性和濃度發(fā)生顯著變化，如圖2所示。隨著飼糧干草含量的減少，一部分變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門及未分類菌的數(shù)量都有所減少，然而厚壁菌門細(xì)菌數(shù)量減少最多;同時(shí)還有少量的變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門的細(xì)菌數(shù)量有所增加。而且只在飼喂25%和7%的干草飼糧中檢測到密螺旋體屬、反芻桿菌屬和毛螺旋菌科的細(xì)菌。這些細(xì)菌大多能分泌各種蛋白酶。二者的研究結(jié)果不相一致，其原因:一方面，兩次研究中飼糧組成存在差異;另一方面，其飼糧中精粗比也不同。Sadet等［10］以小麥麩作為精料主要成分，而Chen等［17］以小麥作為精料主要成分。此外，羊和牛各自不同的物種也可能產(chǎn)生一定的影響。Petri等［15］發(fā)現(xiàn)在飼糧轉(zhuǎn)換過程中，牛鏈球菌(Streptococcus spp.)的相對豐度未發(fā)生變化。不同飼糧組間，瘤胃球菌(Ruminococcus)和普雷沃氏菌(Prevotella spp.)沒有發(fā)生變化，候選門TM7、梭菌門和無壁菌門在混合飼糧組有所增加，互養(yǎng)菌門增加較多，放線菌門在酸中毒時(shí)含量最多，如表4。

當(dāng)飼喂高精料飼糧發(fā)生酸中毒時(shí)，Petri等［15］發(fā)現(xiàn)瘤胃壁黏附細(xì)菌中的奇異菌屬(Atopobium)cc142、乳酸菌 (Lactobacillus)、Olsenella RC39、Sharpea、Solobacterium、琥珀酸菌(Succiniclasticum)和互生球菌屬(Syntrophococcus)的豐度明顯增多。

2.2 宿主效應(yīng)

宿主是影響反芻動(dòng)物瘤胃壁黏附細(xì)菌的重要因素之一。Sadet等［11］研究公羊和肉犢牛瘤胃壁黏附細(xì)菌的多樣性，發(fā)現(xiàn)其瘤胃壁黏附細(xì)菌都含有厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門及螺旋體門的細(xì)菌，其所屬的門類幾乎是一樣，可能某一特定菌屬或菌種存在差異。Sadet等［10］研究發(fā)現(xiàn)盡管給同組羊飼喂完全相同的飼糧，動(dòng)物個(gè)體間的瘤胃壁黏附菌多樣性仍然存在一定差異。Chen等［17］研究發(fā)現(xiàn):試驗(yàn)組中18頭犢牛中只有4頭檢測到無壁菌門和黏膠球形菌門的細(xì)菌;在飼喂97%干草的犢牛個(gè)體170和172中檢測到厚壁桿菌門的細(xì)菌所占百分比最大，然而在飼喂25%干草的犢牛個(gè)體360中也檢測到其數(shù)量最多，這些差異可能也與個(gè)體對pH變化的反應(yīng)機(jī)制不同相關(guān)。Li等［18］閹牛研究中只在102個(gè)體的上皮組織樣中檢測到互養(yǎng)菌(Synergistete)。Petri等［15］發(fā)現(xiàn):飼喂同樣的高精料飼糧時(shí)，犢牛個(gè)體7和41中未檢測到琥珀酸絲狀桿菌(Fibrobacter succinogenes)，犢牛個(gè)體156中琥珀酸絲狀桿菌的豐度最高，Atopobacter F24-B10和U29-B03只在犢牛個(gè)體1和8中發(fā)現(xiàn)。還需進(jìn)一步研究某特定宿主型內(nèi)特殊細(xì)菌群的存在與否，這可能有助于解釋所觀察到個(gè)體間差異。

圖2 不同飼糧組肉牛瘤胃壁黏附菌的細(xì)菌門分類比較Fig.2 Comparison of distributions of rumen epithelial bacteria of cattle at the phylum level among different diet groups［17］

2.3 瘤胃壁部位

由于瘤胃壁黏附細(xì)菌的含量較少且存在于瘤胃內(nèi)容物與宿主上皮組織的交界面，因此在試驗(yàn)研究中采樣部位可能從一定程度上影響其多樣性，但是對這方面的研究很少。為了盡量減少采樣引起的誤差，Mead等［8］研究中從瘤胃壁上5個(gè)不同瘤胃位置(瘤胃背囊近尾部與右縱溝的連接處，瘤胃背囊近尾部，瘤胃前庭，瘤胃后庭及右縱溝處)采樣來研究瘤胃細(xì)菌的多樣性，發(fā)現(xiàn)不同部位瘤胃壁黏附細(xì)菌的數(shù)量和種類都有差異，如只有瘤胃背囊近尾部沒有發(fā)現(xiàn)棲瘤胃擬桿菌(Bacteroides ruminicola)，而且瘤胃背囊的棲瘤胃擬桿菌數(shù)量最多。Sadet等［10］采用這種取樣法，但發(fā)現(xiàn)采樣部位并不影響瘤胃壁黏附細(xì)菌的多樣性。瘤胃壁黏附細(xì)菌在瘤胃壁上可能呈均勻分布;但是也可能某些特殊部位存在差異，其原因尚不清楚，需進(jìn)一步研究。通過PCR-DGGE圖譜分別分析犢牛和肉牛5個(gè)上皮采樣部位(瘤網(wǎng)胃連接處、瘤胃背囊、瘤胃后庭、瘤胃腹囊、瘤胃縱溝)的瘤胃壁細(xì)菌落結(jié)構(gòu)，都未發(fā)現(xiàn)有顯著差異［14］。就目前研究來看，DGGE圖譜對于鑒別瘤胃細(xì)菌的靈敏度還存在一定差異，有待于進(jìn)一步提高其靈敏度。

3 瘤胃壁黏附細(xì)菌的功能

瘤胃壁黏附細(xì)菌存在于特定的生態(tài)位(瘤胃內(nèi)容物和宿主上皮組織的交界處)，具有某些特殊的功能。Wallace等［13］證實(shí)，瘤胃壁黏附細(xì)菌中的微球菌和葡萄球菌能產(chǎn)生高活性的脲酶;此外，這些瘤胃壁黏附菌所產(chǎn)脲酶活性遠(yuǎn)大于瘤胃液中的脲酶(瘤胃液脲酶活性只達(dá)到16%～50%的瘤胃壁黏附菌群脲酶活性)。Mogibacterium對瘤胃氨代謝(主要是氨吸收)很重要［18］。Wells等［20］最新研究發(fā)現(xiàn):羊瘤胃上皮組織內(nèi)的Toll樣受體(TLRs)能識別瘤胃壁黏附細(xì)菌所產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物(主要是丁酸)。而Ster等［21］發(fā)現(xiàn)，丁酸能引發(fā)先天性免疫反應(yīng)，這就能夠促進(jìn)上皮細(xì)胞的增值及上皮屏障功能。Chen等［22］研究發(fā)現(xiàn)，AR組(不易感酸中毒組)瘤胃壁黏附菌能激活先天性免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)上皮屏障功能，以保證瘤胃上皮及瘤胃壁黏附菌群本身免受損害。新發(fā)現(xiàn)的一種瘤胃壁黏附細(xì)菌Azonexus，屬于紅環(huán)菌科的變形菌門，主要由反硝化細(xì)菌組成;放線菌(Actinobacteria)在酸中毒時(shí)含量最高，推測放線菌能產(chǎn)生堿性代謝產(chǎn)物，能中和瘤胃內(nèi)過量的揮發(fā)性脂肪酸［15］。

4 小結(jié)

瘤胃壁黏附菌群含量少，但結(jié)構(gòu)復(fù)雜、多樣，具有重要的屏障功能，與宿主上皮組織循環(huán)和氮素代謝等密切相關(guān)。瘤胃壁黏附菌群多樣性的相關(guān)研究已取得了很大進(jìn)展，但瘤胃黏附菌群中仍存在大量未培養(yǎng)菌，其精確分類和對宿主代謝的功能等問題尚未解決。今后，綜合利用菌體單細(xì)胞分離和元基因組學(xué)等方法，研究瘤胃壁特殊黏附菌群結(jié)構(gòu)，利用元轉(zhuǎn)錄組和代謝組學(xué)等方法研究瘤胃壁黏附菌群在瘤胃和瘤胃壁營養(yǎng)消化、吸收和代謝中的重要作用。

表4 實(shí)時(shí)定量PCR測定不同飼糧處理對瘤胃壁主要黏附菌種相對豐度的影響Table 4 Effects of dietary treatment on the relative abundances of dominant rumen epithelial bacterial species determined by quantitative real-time PCR［15］ %

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