董 菁，薛正蓮，偰德翱，梁 慧

(1.安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽蕪湖 241000;2.蕪湖市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，安徽蕪湖 241000)

植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)［1－2］屬于乳酸菌中的乳桿菌屬，革蘭氏陽性。菌種呈直或彎的桿狀，單個，有時成對或成鏈狀，通常缺乏鞭毛，但能運(yùn)動，不產(chǎn)芽孢。國內(nèi)外學(xué)者對于植物乳桿菌的抑菌活性的研究早有報道。Abo-Amer［3］從酸奶中分離出的73株乳桿菌中篩選出對G+和G－細(xì)菌均有一定抑制作用的植物乳桿菌4株;Wilson等［4］對貯藏溫度為5℃的小蘿卜接種植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)SK1進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在貯藏14 d后，與不接種的實驗組比較，單核李斯特菌(Listeria monocyto-genes)的活菌數(shù)下降得更快。

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureu)屬革蘭氏陽性菌，是引起食物中毒的主要致病菌之一。該菌在自然界中分布較廣，30% ～80%的人群為該病原菌的攜帶者［5］。近幾年來，我國由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒已躍居世界第4位［6］。

本文通過測定植物乳桿菌株對金黃色葡萄球菌的抑菌性能，得到最佳抑菌條件。同時以該植物乳桿菌為出發(fā)菌株，進(jìn)行ARTP常壓室溫等離子體誘變，希望獲得生長速率和抑菌效果均有提高的突變株，從而為乳酸菌劑用于食品防腐貯存、飼料添加菌劑開發(fā)及應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 實驗

1.1 材料

1)實驗菌種

金黃色葡萄球菌ATCC6538，購自美國菌種保藏中心;植物乳桿菌WHLP001，來自本實驗篩查所獲。

2)培養(yǎng)基

MRS 培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨 10.0;牛肉粉5.0;酵母粉4.0;葡萄糖5.0;吐溫802.0;磷酸氫二鉀(7H2O)2.0;乙酸鈉(3H2O)5.0;檸檬酸三銨 2.0;硫酸鎂(7H2O)0.2;硫酸錳(4H2O)0.05;瓊脂15.0。

M17 肉湯(g/L):大豆胨 5.0;肉胨 2.5;酪胨2.5;酵母粉 2.5;牛肉浸膏 5.0;乳糖 5.0;抗壞血酸 0.5;甘油磷酸鈉 19.0;硫酸鎂 0.25。

營養(yǎng)瓊脂(g/L):蛋白胨10.0;牛肉粉3.0;氯化鈉 5.0;瓊脂 15.0。

1.2 實驗設(shè)備

XSP-BM系列生物顯微鏡購自上海彼愛姆光學(xué)儀器制造有限公司;SHP-150智能生化培養(yǎng)箱購自江蘇光都機(jī)電設(shè)備有限公司;SW-CJ-2F超凈工作臺購自蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司;TG-16WS臺式高速離心機(jī)購自長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司;ARTP常壓室溫等離子體誘變系統(tǒng)購自北京思清源生物科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種的活化及生長曲線的測定

將標(biāo)準(zhǔn)儲備的菌株取出，并恢復(fù)至室溫后，按10%(V/V)接種量接種于裝有10 mL MRS液體培養(yǎng)基的50 mL三角瓶中，36℃靜置培養(yǎng)24 h;利用1 cm比色皿，在波長600 nm處，空白選用未加菌株的MRS液體培養(yǎng)基，每隔一定時間取樣，測定其吸光度及pH值，并繪制生長曲線［7］。

1.3.2 牛津杯法測定抑菌活性

1)發(fā)酵液加入量對抑菌效果的影響

按照1.3.1節(jié)的步驟對植物乳桿菌進(jìn)行培養(yǎng)。采用牛津杯法對發(fā)酵液進(jìn)行抑菌實驗，發(fā)酵液加入量分別為 50，100，150，200 μL，以考察加入量對金黃色葡萄球菌的抑菌效果。

2)擴(kuò)散時間對抑菌效果的影響

發(fā)酵液加入量選用150 μL。將加好發(fā)酵液的平皿放置于4℃的冰箱中靜置擴(kuò)散，擴(kuò)散時間分別為 0，4，6，8，10，12 h，再置于培養(yǎng)箱中，36℃培養(yǎng)24 h。

1.3.3 ARTP常壓室溫等離子體誘變

1)菌體的培養(yǎng)

活化后的菌體按1%(V/V)接種量接種于裝有10 mL MRS液體培養(yǎng)基的50 mL三角瓶中，36℃靜置培養(yǎng)至菌體生長到對數(shù)生長期。

2)菌懸液的制備

取1)中菌體原液0.5 mL至4.5 mL的 MRS液體培養(yǎng)基中，制成稀釋液，以菌落數(shù)106～107為宜，濃度用 CFU 法確認(rèn)［8］。取 10 μL滴加在菌物載片中心，注意不要流出。

3)ARTP等離子體誘變

常壓低溫等離子誘變育種裝置:供電電源采用220 V，50 Hz市電，電壓波動范圍小于等于5%;將高純氦氣(99.99%以上高純氦氣)作為等離子體的工作氣體，入口壓力為0.1～0.2 MPa(表壓)。

為了防止操作室內(nèi)細(xì)菌對待處理樣品造成影響，在利用育種機(jī)進(jìn)行誘變育種之前需要對操作室進(jìn)行預(yù)消毒。消毒滅菌15～20 min，氣體流量選用10SLM，溫度40℃以下，選擇照射時間為0，60，90，120，150，180 s。

4)誘變后的培養(yǎng)及計數(shù)

將誘變后的樣品載片迅速放入裝有1 mL MRS液體培養(yǎng)基的離心管中，36℃ ±1℃培養(yǎng)2 h后取出。將離心管混勻，取出0.5 mL置于4.5 mL液體培養(yǎng)基中，依次稀釋至 10－1，10－2，10－3，10－4;取10－2，10－3，10－4稀釋倍數(shù)的 3 管菌懸液，用移液槍吸取100 μL，用涂布棒均勻涂布于MRS平板上，每個稀釋度涂布2塊平板;將涂布后的平板倒置放入培養(yǎng)箱中，36℃ ±1℃培養(yǎng)48 h。

5)存活率的計算

采用菌落計數(shù)法計算菌落存活率，分別計算誘變后和未誘變的菌落數(shù)［9］。計算公式:存活率(%)=(誘變處理后存活的細(xì)胞數(shù)/誘變時間0 s的菌體存活細(xì)胞數(shù))×100%。

6)正突變株的挑選及遺傳穩(wěn)定性

在最佳誘變條件下，挑取生長較好的菌株30株，出發(fā)菌株和誘變株在相同條件下培養(yǎng)，測定OD600值，計算正突變率、正突變幅度。計算公式如下［10］:

正突變率(%)=(OD600比出發(fā)菌株提高的菌株數(shù)/測試的總菌株數(shù))×100%

正突變幅度(%)=(正突變株OD600－出發(fā)菌株的OD600)/出發(fā)菌株OD600×100%

選擇正突變幅度大于15%的菌株作為正突變株，將其連續(xù)8次轉(zhuǎn)接，繼代培養(yǎng)后，測定 OD600值，觀察穩(wěn)定性。

1.3.4 正突變株的抑菌實驗

采用比濁法測定正突變株的抑菌活性。當(dāng)光線通過微生物菌懸液時，由于菌體的散射及吸收作用使光線的透過量降低。

1)指示菌菌懸液的制備

活化后的金黃色葡萄球菌菌種，挑取少量加入無菌生理鹽水中，振蕩試管使菌體分布均勻，與標(biāo)準(zhǔn)比濁管比對，配制成0.5麥?zhǔn)蠞舛鹊木鷳乙簜溆?。該菌懸液濃度可達(dá)107個/mL。

2)植物乳桿菌發(fā)酵液的制備

將符合6)條中的正突變株(符合條件菌株有4株，編號為:120s－8，120s－9，120s－16，120s－18)接種于M17肉湯中，于36℃培養(yǎng)48 h后，按10%接種量再次接種于10 mL M17肉湯中以增強(qiáng)菌種的活性。以未誘變的植物乳桿菌株作為空白。

3)植物乳桿菌株上清液的制備

將經(jīng)培養(yǎng)后的植物乳桿菌發(fā)酵液分別放入滅菌離心管中，5000 r/min離心10 min，取上清液備用。

4)抑菌實驗

取若干裝有10 mL M17肉湯的試管，分別編號為 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，于 10 支試管中分別加入1)中金黃色葡萄球菌菌懸液1 mL;同時于1，2，3，4號管中加入正突變的4株植物乳桿菌株上清液2 mL;于5號試管中加入未經(jīng)誘變的植物乳桿菌上清液 2 mL。培養(yǎng) 24 h 后，于 6，7，8，9，10號試管中依次加入植物乳桿菌株上清液2 mL。以6號試管做空白測定1號試管溶液在600 nm下的吸光度，以7號試管做空白測定2號試管溶液，依次測定。實驗數(shù)據(jù)均為做平行后取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌的生長曲線

由圖1可看出:該植物乳桿菌接種后2 h進(jìn)入對數(shù)生長期，6 h后結(jié)束對數(shù)生長期，進(jìn)入穩(wěn)定期，該穩(wěn)定期時間較長，可持續(xù)18 h，且OD值基本無變化。培養(yǎng)基初始pH值為6.5，4 h后達(dá)到5.0，并一直保持，基本無變化。

圖1 植物乳桿菌的生長曲線

2.2 發(fā)酵液加入量對抑菌效果的影響

由圖2可以看出:隨著植物乳桿菌發(fā)酵液加入量的增加，抑菌效果逐漸增強(qiáng);當(dāng)達(dá)到150 μL時，再增加發(fā)酵液加入量，抑菌效果變化已不明顯。故可確定150 μL為該抑菌實驗的最佳加入量。通過ORGIN軟件對以上數(shù)據(jù)擬合可得R2=0.9327，Y=5.85X+0.0526，故可判斷發(fā)酵液加入量在50～200 μL時，抑菌圈直徑和加入量之間有很好的線性相關(guān)。

圖2 發(fā)酵液加入量對抑菌圈直徑的影響

圖3 不同菌液加入量的抑菌效果

2.3 擴(kuò)散時間對抑菌效果的影響

圖4顯示靜置擴(kuò)散時間對抑菌效果有明顯影響，最佳擴(kuò)散時間為10 h。主要原因是由于150 μL的發(fā)酵液加入量放入冰箱經(jīng)10 h取出后觀察，牛津杯中的發(fā)酵液仍有少量殘留，此時將平皿進(jìn)行培養(yǎng)時，牛津杯中的發(fā)酵液會緩慢滲出，增強(qiáng)抑菌效果。

圖4 擴(kuò)散時間對抑菌圈直徑的影響

2.4 ARTP等離子體誘變的致死效應(yīng)

由圖1可知:該植物乳桿菌在接種6 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，且OD值可達(dá)到1.6。為保證誘變時菌落數(shù)的一致性，選擇穩(wěn)定期菌體細(xì)胞(OD600≥1.6)進(jìn)行誘變。發(fā)現(xiàn)在10－3稀釋倍數(shù)平板上的菌落數(shù)更便于計數(shù)，故選擇在10－3稀釋倍數(shù)平板上的平均菌落數(shù)統(tǒng)計存活率。由表1可知，照射時間為120 s和150 s時，致死率可達(dá)到99.01%。

表1 不同誘變時間與菌落存活率的關(guān)系

2.5 正突變的誘變株的挑選及遺傳穩(wěn)定性

將誘變照射時間為120、150 s的10－3稀釋倍數(shù)的2塊平板上菌落挑取后接種于MRS液體培養(yǎng)基中(10%接種量)，測定OD600，發(fā)現(xiàn)誘變照射時間為120 s的OD600值較高，故確定最佳誘變照射時間為120 s。在120 s照射時間下挑選的30株突變株中，其中OD600值增加的菌株有10株，正突變率為 33.33%;編號 120s－8、120s－9、120s－16、120s－18的突變株的正突變率分別為17.28%，19.01%，19.31%，19.43%(見表 2)。將該4株菌株在MRS液體培養(yǎng)基中傳代8次后，測定OD600值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OD600值未發(fā)現(xiàn)明顯改變，表明經(jīng)誘變后的菌株產(chǎn)量性狀在傳代過程中基本保持穩(wěn)定。故將該4株菌株保存，以出發(fā)菌株作對照，利用比濁法測定該4株菌株對金黃色葡萄球菌的抑菌性能。

2.6 正突變株的抑菌活性的測定

對編號120s－8、120s－9、120s－16、120s－18的突變株進(jìn)行抑菌實驗，以出發(fā)菌株作對照。結(jié)果發(fā)現(xiàn):該4株菌株的發(fā)酵上清液對金黃色葡萄球菌的抑菌活性均有所增強(qiáng)，編號120s－18的突變株較出發(fā)菌株的抑菌活性增強(qiáng)的幅度最大，吸光度較空白減少了60.8%，較出發(fā)菌株的抑菌率提高了37.48%。實驗結(jié)果證明該誘變方法對植物乳桿菌的抑菌活性的增強(qiáng)效果比較明顯。

3 討論與結(jié)論

植物乳桿菌對金黃色葡萄球菌的抑菌實驗中，通過優(yōu)化發(fā)酵液加入量和擴(kuò)散時間，得到最佳抑菌條件:發(fā)酵液加入量為150 μL，擴(kuò)散時間為10 h。用ARTP對植物乳桿菌進(jìn)行誘變處理，誘變照射時間為120 s時致死率可達(dá)99.01%，此時的正突變率也最高，可達(dá)33.33%。同時發(fā)現(xiàn)有4株菌株的生長速率和抑菌效果較出發(fā)菌株有較大提高。編號120s－18的突變株較出發(fā)菌株的抑菌活性增強(qiáng)的幅度最大，吸光度較空白減少了60.8%，而出發(fā)菌株較空白的吸光度只減小了44.2%，且該菌株培養(yǎng)24 h后的OD600值為1.973，相同培養(yǎng)條件下出發(fā)菌株的OD600值為1.652。故可知編號120s－18的突變株較出發(fā)菌株其生長速率和抑菌率分別提高了19.43%和37.48%。說明植物乳桿菌在經(jīng)ARTP等離子誘變選育后，對金黃色葡萄球菌的抑菌性能不僅未發(fā)生改變，反而增強(qiáng)了。植物乳桿菌發(fā)酵液和上清液的抑菌試驗均顯示出較好的抑菌效果，說明植物乳桿菌的發(fā)酵產(chǎn)物中具有抑菌物質(zhì)。

該研究成功獲得了一株菌體生長速率和抑菌活性均得到較大提高的植物乳桿菌株。后續(xù)實驗將對常見乳酸菌對所有腐敗菌的抑制作用建立一個乳酸菌的抑菌圖譜，這樣就為不同食品可采用何種抗菌物質(zhì)進(jìn)行防腐最有效，以及該種抗菌物質(zhì)可從何種乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)物中提取提供了一個依據(jù)，從而為乳酸菌劑用于食品防腐貯存及飼料添加菌劑開發(fā)及應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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