宋利偉 張存旭 康永祥 王 豪

(西北農(nóng)林科技大學(xué)，楊凌，712100)

太白米[Notholin hyacinthinum(wils)staff]，又名假百合，系百合科假百合屬的多年生草本植物。其具有寬胸理氣、健胃鎮(zhèn)痛、祛風(fēng)止咳等功效，主要用于對(duì)淺表性胃炎、萎縮性胃炎及胃痛腹脹、嘔吐、風(fēng)寒咳嗽等的治療[1]，多數(shù)情況下，與其他藥物配合，對(duì)肝癌、胃癌、食道癌等疾病的治療有特殊功效，因此，被視為名貴中草藥[2]。由于其顯著療效及多樣化的用途，人們對(duì)其需求日益增長(zhǎng)。太白米生長(zhǎng)高山之上，主要由天然資源供應(yīng)，長(zhǎng)期盲目的采用，又加上人們對(duì)植物藥的需求量日益劇增，使得這一野生資源近于枯竭[3]。保護(hù)和大規(guī)模栽植這一重要物種迫在眉睫。為此，早在20世紀(jì)80年代太白米就被列為太白山國(guó)家自然保護(hù)區(qū)珍稀瀕危植物之一[2]，并開(kāi)展了一系列的相關(guān)栽培技術(shù)研究[4－5]。在自然條件下，太白米依靠鱗莖進(jìn)行無(wú)性繁殖，一般周期長(zhǎng)、繁殖率低[6];因其為種子后熟植物，種子細(xì)小、休眠期長(zhǎng)、發(fā)芽率低，故一般不用種子繁殖[4]。因此，對(duì)太白米進(jìn)行組織快繁培養(yǎng)，以便大面積的人工栽培擴(kuò)大藥源十分必要。與傳統(tǒng)繁殖方法相比，植物組織培養(yǎng)快繁技術(shù)能在較短的時(shí)間內(nèi)提供大量的優(yōu)質(zhì)種苗，越來(lái)越受到人們的重視，并在生產(chǎn)上得到了廣泛應(yīng)用[7－8]。有關(guān)太白米的組織培養(yǎng)研究鮮有報(bào)道[3，9－10]，且均未完成植株再生方案的建立。文中旨在通過(guò)系統(tǒng)研究太白米離體愈傷組織的誘導(dǎo)及植株再生過(guò)程，建立一套完整的太白米植株再生體系，為工廠化生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

2012年7月份，在陜西太白山采挖優(yōu)良野生植株，立即帶回實(shí)驗(yàn)室。以葉片、鱗莖的外鱗片、小鱗莖、鱗葉以及組織培養(yǎng)獲得的不定芽，作為起始外植體。

外植體消毒條件的建立:取太白米葉片、鱗莖的外鱗片、剝?nèi)ズ稚鈿さ男△[莖，用洗潔精浸泡10～15 min，流水沖洗1 h，無(wú)菌條件下，葉片用75%酒精消毒6 s、其余外植體75%酒精消毒30 s，無(wú)菌水沖洗2次，葉片及鱗莖的外鱗片用0.1%HgCl2消毒6 min、小鱗莖消毒10 min，無(wú)菌水沖洗5～6次，將外鱗片與葉片(含有中脈)切成約1 cm×1 cm、不定芽切為長(zhǎng)1～1.5 cm，鱗片、小鱗莖及鱗葉凹面朝上，葉片遠(yuǎn)軸面朝上，不定芽水平放置，接種于培養(yǎng)基中。

培養(yǎng)基配制:愈傷組織誘導(dǎo)以MS(Murashige and Skoog，1962)為基本培養(yǎng)基，分別添加 NAA(0.1、0.5、1.0 mg·L－1)、2，4－D(0.1、0.5 mg·L－1)、0.1 mg·L－16－BA+0.5 mg·L－1NAA、0.1 mg·L－16－BA+0.5 mg·L－12，4－D。

將初代培養(yǎng)的愈傷組織轉(zhuǎn)接到MS附加0.5mg·L－1NAA的增殖培養(yǎng)基上，每隔28 d繼代一次。將增殖后的愈傷組織切成3 mm×3 mm×3 mm左右，轉(zhuǎn)接到不同的分化培養(yǎng)基上:MS分別添加TDZ(0.1、0.5、1.0 mg·L－1)、6－BA(0.1、0.5、1.0 mg·L－1)、1.0 mg·L－16－BA+0.1 mg·L－1NAA。

將長(zhǎng)約3 cm的不定芽從基部切下，轉(zhuǎn)接到添加NAA 梯度為 0.5、1.0 mg·L－1的 MS 和 1/2MS 的生根培養(yǎng)基中。

所有培養(yǎng)基均添加 30 g·L－1蔗糖、6 g·L－1瓊脂(產(chǎn)地:北京)、0.5 g·L－1水解酪蛋白;pH 值調(diào)至5.8，于121℃高壓濕熱滅菌20 min。

培養(yǎng)條件:培養(yǎng)容器均采用青色琉璃瓶(60 mm×90 mm)，培養(yǎng)室溫度(25±1)℃，采用暗培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織，其余為光培養(yǎng)，以光照強(qiáng)度為50 umol·m－2·s－1的冷白熒光燈管為光源，光照 14 h·d－1。

試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析:誘導(dǎo)愈傷組織階段每個(gè)處理6瓶，每瓶5個(gè)外植體;誘導(dǎo)分化芽階段每個(gè)處理5瓶，每瓶4個(gè)外植體;誘導(dǎo)生根階段每個(gè)處理5瓶，每瓶4個(gè)外植體;所有試驗(yàn)均重復(fù)3次。統(tǒng)計(jì)參數(shù)包括:愈傷組織誘導(dǎo)率=(長(zhǎng)愈傷的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù))×100%，愈傷組織形成所需時(shí)間;芽分化率=(長(zhǎng)芽的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù))×100%，增殖后芽長(zhǎng)及個(gè)數(shù);生根誘導(dǎo)率=(生根的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù))×100%，根長(zhǎng)及個(gè)數(shù)。所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，其中包括方差分析、Duncan’s多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織的誘導(dǎo)

2.1.1 外植體類型對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

將不同類型的外植體接種到 MS+1.0 mg·L－1NAA+1.0 mg·L－12，4－D 的培養(yǎng)基中。3 d 后小鱗莖稍有膨大，5 d后鱗片膨大，7 d后鱗葉膨大。所有外植體都有不同程度的褐化現(xiàn)象，其中葉片褐化最為嚴(yán)重，鱗片次之，小鱗莖、鱗葉、不定芽較輕。不同類型外植體上均有愈傷組織形成(圖1A～E)，其中以鱗片上出現(xiàn)的最早，約為9 d;不定芽上的最晚，約為24 d。葉片、鱗片及不定芽的愈傷組織形成于切口邊緣;鱗葉、小鱗莖在基部或切口邊緣，且伴隨有鱗芽的萌發(fā)。30 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率(表1)。方差分析表明，不同外植體愈傷組織誘導(dǎo)率間存在極顯著差異(P＜0.01)，其中以鱗葉誘導(dǎo)率最高，為75.5%;葉片的最低，為3.3%。葉片愈傷組織為白色，質(zhì)地疏松;不定芽的為黃色、瘤狀，質(zhì)地緊密;其余均為淡黃色、瘤狀，質(zhì)地緊密。

表1 外植體類型對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.1.2 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

將鱗葉接種于MS附加不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基上，7 d稍有膨大，12 d左右在鱗葉基部或切口處產(chǎn)生淡黃色愈傷組織，30 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率(表2)。方差分析表明，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響極顯著(P＜0.01)。不同處理均有淡黃色、瘤狀、緊密的愈傷組織形成。分別附加0.5 mg·L－1NAA、0.5 mg·L－1NAA+0.1 mg·L－16－BA的MS培養(yǎng)基中的愈傷組織出現(xiàn)的最早，約為12 d;MS+0.1 mg·L－1NAA中的愈傷組織出現(xiàn)的最晚，約為22 d。MS+0.5 mg·L－1NAA 中的愈傷組織誘導(dǎo)率最高，可達(dá) 90.5%;MS+1.0 mg·L－1NAA 中的最低，為47.1%。單獨(dú)添加生長(zhǎng)素時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率高于生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素組合。

表2 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)鱗葉愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.2 愈傷組織增殖與芽的分化

2.2.1 愈傷組織的增殖

將初代培養(yǎng)的愈傷組織，轉(zhuǎn)接到附加不同種類和不同質(zhì)量濃度植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基上。隨著繼代次數(shù)的增加，有些愈傷組織上直接長(zhǎng)出白色的不定根且有不同程度的褐化現(xiàn)象。當(dāng)NAA質(zhì)量濃度分別降低為 0.1、0.2、0.3 mg·L－1后，培養(yǎng) 28 d，其中添加0.3 mg·L－1NAA 的培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)有不定根生成和褐化現(xiàn)象;質(zhì)量濃度為 0.2 mg·L－1時(shí)，無(wú)不定根形成，但愈傷組織增殖緩慢;在質(zhì)量濃度為 0.1 mg·L－1的培養(yǎng)基上，愈傷組織生長(zhǎng)旺盛，富有光澤，且增殖較快(圖1F)。

圖1 太白米愈傷組織的誘導(dǎo)及植株再生

2.2.2 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)不定芽分化及生長(zhǎng)的影響

將繼代3次后的愈傷組織轉(zhuǎn)接到不同的分化培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)不定芽分化。15 d左右，在附加0.1 mg·L－1TDZ培養(yǎng)基的愈傷組織表面凸現(xiàn)少量淺白色的芽點(diǎn);在 MS+0.1 mg·L－16－BA 的培養(yǎng)基上不定芽出現(xiàn)的最晚，為20 d左右，45 d后芽叢數(shù)目增多且顏色轉(zhuǎn)綠(圖1G)。方差分析表明，不同處理芽分化率間存在極顯著差異(P＜0.01)。由表3可知，隨 TDZ 質(zhì)量濃度增加(0.1～1.0 mg·L－1)，芽分化率明顯降低;而6－BA對(duì)芽分化的影響，則隨質(zhì)量濃度的增加而增加。

單獨(dú)使用低質(zhì)量濃度的TDZ(0.1 mg·L－1)時(shí)，不定芽平均個(gè)數(shù)可達(dá)7.4個(gè)、長(zhǎng)度可達(dá)4.8 cm，伸長(zhǎng)效果較佳，但叢生芽細(xì)弱，不利于生根培養(yǎng);隨著濃度的增加，叢生芽數(shù)及長(zhǎng)度均有所下降，所以高濃度TDZ不利于芽的增殖。單獨(dú)附加6－BA時(shí)，隨濃度的增加，叢生芽數(shù)增多;當(dāng)6－BA質(zhì)量濃度為1.0 mg·L－1時(shí)，叢生芽數(shù)最多，約平均為 7.6 個(gè)、平均長(zhǎng)度可達(dá)4.3 cm，但同樣出現(xiàn)叢生芽細(xì)弱的現(xiàn)象，有些甚至形成了畸形芽。在 MS+1.0 mg·L－16－BA+0.1 mg·L－1NAA的培養(yǎng)基上的叢生芽數(shù)最多，平均約為9個(gè)，平均長(zhǎng)度為3.5 cm，且叢生芽生長(zhǎng)健壯，適于生根培養(yǎng)。

2.3 生根誘導(dǎo)

將長(zhǎng)約3 cm的芽從基部切下，轉(zhuǎn)接到不同的生根培養(yǎng)基中(表4)。20 d左右，在1/2MS+NAA1.0 mg·L－1培養(yǎng)基中，芽基部膨大處凸顯白色小點(diǎn);其余在25 d出現(xiàn)白色小點(diǎn)。培養(yǎng)40 d后，長(zhǎng)出細(xì)絲毛狀約0.5 cm的不定根，且基部都有不同程度的愈傷化，60 d左右根長(zhǎng)可達(dá)1～2 cm，其上有許多須根(圖1H)。方差分析表明，不同培養(yǎng)基間生根率差異不顯著(P=0.132)，但平均根數(shù)(P=0.010)及根長(zhǎng)(P=0.042)存在顯著差異。其中添加不同質(zhì)量濃度的NAA的MS培養(yǎng)基上的根生長(zhǎng)細(xì)弱，個(gè)數(shù)較少，生長(zhǎng)緩慢;添加 1.0 mg·L－1NAA 的 1/2MS培養(yǎng)基上的根長(zhǎng)勢(shì)粗壯，根毛較多，且生根率較高，其平均根數(shù)為 9.8 個(gè)、平均根長(zhǎng)為 2.2 cm。

表3 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)不定芽分化的影響

2.4 馴化移栽

待根長(zhǎng)至2 cm左右時(shí)，開(kāi)瓶2 d，小心洗去上面殘留的瓊脂培養(yǎng)基，移入V(腐殖質(zhì))∶V(蛭石)∶V(沙)=1∶1∶1的基質(zhì)中，濕度保持在80%，自然光50%的條件下，培養(yǎng)15 d轉(zhuǎn)移到通風(fēng)透光處，獲得太白米植株(圖1I)。

表4 不同處理對(duì)生根的影響

3 結(jié)論與討論

在離體繁殖中，愈傷組織的誘導(dǎo)、生長(zhǎng)和發(fā)育受到諸多因子的影響，如外植體類型、不同的光照條件和光周期、培養(yǎng)基、溫度等。尤其是植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)影響顯著，生長(zhǎng)素在愈傷組織誘導(dǎo)及生長(zhǎng)過(guò)程中起著主要作用[12]。在太白米的離體繁殖中，大多采用小鱗莖作為外植體，亦有人以葉片為外植體，但尚未有葉片愈傷組織的報(bào)道[3，5]，更少有以鱗片、鱗葉以及愈傷組織誘導(dǎo)出的不定芽為外植體。本試驗(yàn)通過(guò)太白米不同外植體類型及植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的研究，首次從鱗片和葉片上誘導(dǎo)出愈傷組織;鱗葉愈傷組織的誘導(dǎo)率高于其他外植體，且高于已有文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果[13]。不同外植體上愈傷組織的誘導(dǎo)能力不同，表明植物材料本身各個(gè)部位的生理狀態(tài)不同。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)鱗葉愈傷組織誘導(dǎo)的結(jié)果表明，其最適培養(yǎng)基為MS+0.5 mg·L－1NAA。

愈傷組織增殖及不定芽分化是影響太白米離體快繁的主要因素。結(jié)果表明，低質(zhì)量濃度的NAA(0.1 mg·L－1)更有利于愈傷組織的增殖。一般來(lái)說(shuō)，生長(zhǎng)素用于愈傷組織的誘導(dǎo)和增殖;而生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素共同作用于愈傷組織的再分化[14]。在誘導(dǎo)器官分化途徑上，低質(zhì)量濃度的TDZ可誘導(dǎo)不定芽產(chǎn)生，被認(rèn)為是比其他細(xì)胞分裂素更有效的一種激素，且已廣泛應(yīng)用于百合科的許多植物中[15－18]。本研究結(jié)果顯示，MS+0.1 mg·L－1TDZ培養(yǎng)基中的愈傷組織分化率最高，而 MS+1.0 mg·L－16－BA+0.1 mg·L－1NAA 培養(yǎng)基中芽的增殖效果最好。

植物生根是移栽成苗的關(guān)鍵步驟，其受基本培養(yǎng)基與植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的影響。研究結(jié)果表明，1/2MS+1.0 mg·L－1NAA 的培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根效果最好，誘導(dǎo)率可達(dá)91.4%，且不定根長(zhǎng)勢(shì)健壯，故最適合生根培養(yǎng)。

綜上所述，通過(guò)組織培養(yǎng)器官發(fā)生途徑，獲得了太白米再生植株，初步建立了一套離體快繁培養(yǎng)體系。但要投入商業(yè)化應(yīng)用，仍然需要開(kāi)展進(jìn)一步的研究工作，如愈傷組織增殖的液體培養(yǎng)、降低培養(yǎng)成本等。

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