黃濤 朱泓 王小敏 吳文龍 李維林

(江蘇省中國科學(xué)院植物研究所，南京，210014)

我國沿海有豐富的鹽堿土和灘涂資源，是緩解人口增長與耕地減少矛盾的最具潛力的土地后備資源。目前，沿海灘涂開發(fā)中普遍存在物種單一、結(jié)構(gòu)簡單、經(jīng)濟(jì)效益低、自我調(diào)控力弱和生態(tài)系統(tǒng)受損退化等問題，研究適合鹽土生長的經(jīng)濟(jì)植物，可為高效開發(fā)和可持續(xù)利用沿海灘涂資源，實(shí)現(xiàn)沿海經(jīng)濟(jì)社會(huì)和生態(tài)環(huán)境協(xié)調(diào)發(fā)展提供技術(shù)支撐。

濱梅(Prunus maritima Marshall)是薔薇科的一種鹽生灌木，是目前發(fā)現(xiàn)的最耐鹽堿的木本果樹。濱梅根系發(fā)達(dá)，具有耐旱、耐貧瘠、耐鹽堿等方面的抗逆性，可用于海岸灘涂修復(fù)和沙丘固定，是一種花果兩用的耐鹽新經(jīng)濟(jì)樹種。國外的一些研究機(jī)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，濱梅能在pH值8.0和0.9%NaCl脅迫下正常生長[1]。扦插繁殖是木本植物栽培過程中最為常用的無性繁殖手段之一，其優(yōu)點(diǎn)在于簡便、快速、經(jīng)濟(jì)，同時(shí)能夠保持母體植株的所有優(yōu)勢。迄今為止，濱梅無性繁殖技術(shù)的研究已取得了一定進(jìn)展[2－5]，但相對于種子苗的耐鹽性研究[6－8]，無性繁殖植株的耐鹽性研究仍停留在組培水平[9]，扦插苗耐鹽能力研究尚未展開。開展濱梅扦插苗耐鹽能力的研究，對濱梅的推廣具有重要的理論價(jià)值。為此，文中對NaCl脅迫下濱梅扦插苗生長和生理響應(yīng)變化規(guī)律進(jìn)行了研究，以期為新型耐鹽經(jīng)濟(jì)植物的遴選提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

材料:1年生且生長良好的濱梅扦插苗。

儀器:美能達(dá)SPAD－501便攜葉綠素儀，Thermo Scientific Orion Star A，Molecular Devices SPECTRA max PLUS 384。

試劑:磷酸緩沖液(pH=7.4)，甲硫氨酸(Met)溶液，核黃素溶液，氮藍(lán)四唑溶液，EDTA－Na2溶液，0.2%愈創(chuàng)木酚，H2O2溶液，牛血清白蛋白，90%乙醇，85%磷酸，考馬斯亮藍(lán)G－250溶液，Na+測試試劑，連二亞硫酸鈉，1%TTC 溶液，1 mol·L－1硫酸，0.5%硫代巴比妥酸(TBA)，三氯乙酸(TCA)。

試驗(yàn)采用盆栽方式，塑料盆底徑13.5 cm、口徑15 cm、高18 cm，每盆裝入磨細(xì)過篩的輕壤質(zhì)干土3 kg。2013年4月初，每盆栽種1年生且生長均勻的濱梅扦插苗1株，先用淡水澆灌，4月中旬待苗木恢復(fù)正常生長后，開始換用不同質(zhì)量濃度NaCl溶液澆灌，NaCl溶液的質(zhì)量濃度分別為 0(對照，CK)、1.5、2.9、5.8、8.8、11.7、14.6 g·L－1，每處理重復(fù) 3 次，隨機(jī)區(qū)組排列。每盆每次澆300 mL NaCl溶液，每隔4 d澆1次，持續(xù)40 d，之后用淡水澆灌，80 d后結(jié)束試驗(yàn)。

生長指標(biāo):處理80 d時(shí)測定各植株新萌枝長，同時(shí)分別取5盆濱梅，測定地上部分、地下部分生物量，經(jīng)殺青、烘干測得干質(zhì)量(于105℃殺青15 min，后在60℃下烘干至恒質(zhì)量)，計(jì)算鮮質(zhì)量、干質(zhì)量、根冠比增幅及含水率。

生理指標(biāo):處理40、80 d時(shí)分別選擇各處理植株第4～5片正常生長的功能葉測定生理指標(biāo)，其中超氧化物歧化酶(SOD)采用氮藍(lán)四唑(NBT)光還原法測定，過氧化物酶(POD)采用愈創(chuàng)木酚比色法測定，過氧化氫酶(CAT)采用紫外吸收法測定，可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)采用考馬斯亮藍(lán)法測定，Na+濃度采用試劑盒法測定;葉片的葉綠素相對含量用SPAD值表示，采用美能達(dá)SPAD－501便攜葉綠素儀在09:00—11:00 測定[10]，重復(fù) 3 次，取平均值;根系活力采用氯化三苯基四氮唑(TTC)比色法測定;土壤pH值測定參照李強(qiáng)等[11]的方法;電導(dǎo)率測定參照李東順等[12]的方法;在處理80 d時(shí)用電導(dǎo)法測定植株抗逆性(質(zhì)膜透性)，用硫代巴比妥酸(TBA)比色法測定葉片丙二醛(MDA)質(zhì)量摩爾濃度。

植物組織受到逆境傷害時(shí)，由于膜的功能受損或結(jié)構(gòu)破壞，而使其透性增大，因此，通過測定組織外滲液相對電導(dǎo)率(RE，C)，說明外滲狀況即植物傷害程度，可判定植物抗逆能力。植物器官在逆境脅迫下，膜脂過氧化產(chǎn)物MDA的積累表明膜脂損傷的加劇。植物組織中可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)是植物生理研究中的重要指標(biāo)，它代表胞液的濃度及組織代謝的水平，反映出組織生理活性的高低。SOD、POD、CAT都與植物抗逆性密切相關(guān)，其機(jī)理是減輕活性氧或其他過氧化物自由基對細(xì)胞膜系統(tǒng)的傷害。根系是植物抵御鹽脅迫的重要屏障，根系的生長發(fā)育還會(huì)影響植物對水分和營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，進(jìn)而影響地上部莖葉的生長。根系脫氫酶活力反映了根系呼吸作用的強(qiáng)弱，是反映根系活力的重要指標(biāo)[12]。葉片SPAD值與葉片總?cè)~綠素含量有極顯著的正相關(guān)關(guān)系，可以很好地反映葉綠素含量，且測定不會(huì)破壞植物葉片，不受時(shí)間、氣候等條件的限制[10]。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2010和SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用 Duncan’s法進(jìn)行多重比較(P＜0.05)。

含水率=[(鮮質(zhì)量－干質(zhì)量)/鮮質(zhì)量]×100%。

根冠比=植株地下部干質(zhì)量/植株地上部干質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaCl脅迫對濱梅扦插苗生長的影響

從表1可見，不同質(zhì)量濃度NaCl溶液脅迫下，各處理植株地上部、地下部的鮮質(zhì)量和干質(zhì)量、根冠比以及萌枝長度均表現(xiàn)了不同程度的差異性變化(P＜0.05)，從中可以發(fā)現(xiàn)以下規(guī)律:在 1.5～2.9 g·L－1的低質(zhì)量濃度NaCl脅迫下，植株地上、地下部分鮮質(zhì)量、地下部分干質(zhì)量及根冠比均高于對照，地上部分干質(zhì)量與對照相當(dāng)或略低，萌枝長度略低于對照，說明濱梅在低鹽土壤環(huán)境中會(huì)通過根系的補(bǔ)償性生長保持整個(gè)植株的良好生長;當(dāng)NaCl質(zhì)量濃度超過5.8 g·L－1后，植株地上、地下部分鮮質(zhì)量和干質(zhì)量、根冠比、萌枝長呈下降趨勢，而且除地下部分鮮質(zhì)量外都顯著低于對照，說明高質(zhì)量濃度NaCl脅迫對濱梅生長有顯著影響;在NaCl鹽脅迫下，濱梅地下部分的鮮、干質(zhì)量均呈現(xiàn)下降趨勢，但是大部分處理的鮮質(zhì)量及所有處理的含水率均高于對照(NaCl處理質(zhì)量濃度 2.9 g·L－1時(shí)的含水率異常，可能是試驗(yàn)中的偶然偏差)，說明鹽脅迫下濱梅根系有通過超常吸水來稀釋根內(nèi)鹽質(zhì)量濃度從而緩解鹽害的能力，這也許是濱梅耐鹽機(jī)理的重要表觀現(xiàn)象。

試驗(yàn)中的外觀觀察結(jié)果顯示，1.5～2.9 g·L－1NaCl處理下濱梅長勢正常，甚至部分植株還略好于對照，在5.8 g·L－1NaCl處理下濱梅長勢基本正常，說明濱梅可能是一種喜鹽植物;8.8 g·L－1NaCl處理下，早期濱梅植株生長正常，之后大部分植株逐漸呈輕微失綠癥狀，有少許葉片發(fā)黃、卷曲，并自下而上開始落葉;NaCl質(zhì)量濃度高于 8.8 g·L－1后，從處理開始，大部分植株即逐漸失綠，部分葉片發(fā)黃、卷曲，后期落葉現(xiàn)象嚴(yán)重。以上外觀表現(xiàn)顯示，濱梅在1.5～5.8 g·L－1NaCl脅迫下可以正常生長，能短期忍受8.8 g·L－1NaCl脅迫，在更高質(zhì)量濃度鹽脅迫下濱梅不能正常生長。

2.2 NaCl脅迫對濱梅扦插苗生理指標(biāo)的影響

2.2.1 葉片SPAD值的變化

從表2可見，NaCl處理40 d時(shí)，各處理與對照相比，濱梅扦插苗葉片SPAD值沒有顯著差異，表明短時(shí)間脅迫對濱梅葉片的葉綠素含量沒有顯著影響;處理80 d 后，鹽質(zhì)量濃度在 8.8 g·L－1以上的葉片SPAD值與對照相比顯著降低，表明長時(shí)間高鹽脅迫開始破壞葉綠素合成。

表1 不同質(zhì)量濃度NaCl處理80 d后濱梅扦插苗生長狀況

表2 NaCl脅迫下濱梅葉片SPAD值的變化

2.2.2 細(xì)胞膜透性的變化

由表3可知，經(jīng)NaCl處理80 d時(shí)，各處理組MDA質(zhì)量摩爾濃度均高于對照，在質(zhì)量濃度為2.9 g·L－1時(shí)，MDA質(zhì)量摩爾濃度達(dá)到最高，且與對照差異顯著，然后，隨著鹽質(zhì)量濃度的增加而降低，但在質(zhì)量濃度為14.6 g·L－1時(shí)，MDA 質(zhì)量摩爾濃度又增加。說明濱梅在較低鹽質(zhì)量濃度下膜脂過氧化反應(yīng)強(qiáng)烈，但受到高質(zhì)量濃度鹽脅迫時(shí)細(xì)胞膜受到破壞，MDA質(zhì)量摩爾濃度又繼續(xù)增加。

各質(zhì)量濃度NaCl處理80 d的濱梅葉片中可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化不大，除經(jīng)11.7 g·L－1質(zhì)量濃度處理的可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，且與對照差異顯著外，其他與對照均無顯著差異，說明濱梅葉片組織的細(xì)胞代謝及生理活性在鹽質(zhì)量濃度增加時(shí)未受到顯著影響。當(dāng)NaCl脅迫等于或低于8.8 g·L－1時(shí)，濱梅葉片的RE，C與對照相比無顯著差異，當(dāng)質(zhì)量濃度為 11.7 g·L－1時(shí)，濱梅葉片的 RE，C增加，與對照相比存在較大差異(表3)，表明濱梅扦插苗葉片具有一定的抗鹽脅迫的能力。

2.2.3 保護(hù)酶活性的變化

由表 4 可知，鹽處理 40 d 后，經(jīng) 8.8 g·L－1NaCl質(zhì)量濃度處理的SOD活性與對照相比差異不顯著，在高于8.8 g·L－1NaCl脅迫時(shí)的SOD活性顯著高于對照。經(jīng)8.8 g·L－1NaCl處理的POD活性與對照相比無顯著差異，高于8.8 g·L－1時(shí) POD活性顯著高于對照。CAT活性隨著鹽處理質(zhì)量濃度升高與對照相比無顯著變化，但在8.8 g·L－1處理時(shí)達(dá)到最高，高于8.8 g·L－1后略有下降。經(jīng)鹽處理80 d后，經(jīng)8.8 g·L－1NaCl質(zhì)量濃度處理的SOD活性與對照相比差異不顯著，鹽質(zhì)量濃度高于8.8 g·L－1后與對照相比顯著降低;經(jīng)8.8 g·L－1NaCl質(zhì)量濃度處理的POD活性與對照相比顯著增加，鹽質(zhì)量濃度高于8.8 g·L－1后活性繼續(xù)升高;CAT 活性經(jīng) 8.8 g·L－1NaCl處理后顯著高于對照，鹽質(zhì)量濃度高于8.8 g·L－1后活性均略有下降但仍顯著高于對照。

表3 NaCl脅迫80 d后對濱梅葉片細(xì)胞膜透性的影響

2.2.4 根系活力的變化

濱梅扦插苗經(jīng)NaCl處理后，根系活力隨脅迫時(shí)間的增長而增強(qiáng)，當(dāng) NaCl脅迫低于 11.7 g·L－1時(shí)，隨脅迫質(zhì)量濃度的升高根系活力增強(qiáng)(表5)，當(dāng)NaCl脅迫為 11.7 g·L－1時(shí)，根系活力達(dá)到最高，為對照的 1.44 倍，但當(dāng) NaCl脅迫為 14.6 g·L－1時(shí)，根系活力急劇下降。根系是最先感觸鹽脅迫的部位，濱梅根系活力在中低度鹽脅迫下呈現(xiàn)活力增強(qiáng)的現(xiàn)象，說明了濱梅根系具有較強(qiáng)的抵御鹽脅迫逆境的能力。

表4 NaCl脅迫對濱梅葉片保護(hù)酶活性的影響

表5 NaCl脅迫對濱梅根系活力的影響

2.2.5 葉片 Na+濃度的變化

不同質(zhì)量濃度NaCl溶液處理后，盆栽土壤中的鹽分變化極其顯著。8.8 g·L－1NaCl溶液處理40、80 d后土壤電導(dǎo)率分別為對照的 4.06、5.95 倍;經(jīng)11.7 g·L－1NaCl溶液處理 40、80 d 后土壤電導(dǎo)率分別為對照的 5.45、6.13 倍。此時(shí)，葉片中 Na+濃度的高低最為直接地反映了植株對脅迫抵抗的能力。由表6可見，經(jīng)NaCl溶液處理40 d，葉片Na+濃度均高于對照;經(jīng) 11.7 g·L－1NaCl溶液處理 40 d，葉片 Na+濃度為對照的2.53倍，顯著高于對照。NaCl溶液處理 80 d 后，經(jīng) 2.9～11.7 g·L－1NaCl溶液處理葉片中Na+濃度均顯著提高，但當(dāng)NaCl溶液達(dá)到8.8 g·L－1以上時(shí)，葉片中Na+濃度才顯著高于前一個(gè)梯度處理樣品，經(jīng) 8.8 g·L－1NaCl溶液處理 80 d后葉片Na+濃度為對照的 1.46 倍，經(jīng) 11.7 g·L－1NaCl溶液處理80 d后葉片Na+濃度為對照的1.57倍，葉片中Na+濃度的增長率顯著低于土壤中鹽分的增長率。

表6 不同質(zhì)量濃度NaCl處理下土壤電導(dǎo)率和濱梅葉片鈉離子濃度變化

3 結(jié)論與討論

鹽脅迫下，植物的生物量變化狀況直觀地反映其對不同質(zhì)量濃度鹽處理的響應(yīng)[13]。本試驗(yàn)中濱梅扦插苗的生物量隨NaCl處理質(zhì)量濃度升高呈先升后降的趨勢，這與王利民等[7]對濱梅種子苗的研究結(jié)果基本一致。葉片SPAD值反映了葉片總?cè)~綠素含量[10]，試驗(yàn)中在低質(zhì)量濃度鹽處理時(shí)濱梅葉片SPAD值與對照相比差異不顯著，在高質(zhì)量濃度鹽處理下則顯著低于對照，這與吳月燕等[14]對杜鵑的研究一致，表明葉綠素的合成受到抑制，濱梅的葉片出現(xiàn)黃化現(xiàn)象也體現(xiàn)了這一差異。NaCl脅迫下濱梅葉的SOD、POD、CAT及根系活力均隨鹽處理質(zhì)量濃度增加呈上升趨勢，但在高鹽度處理后有下降趨勢，這與楊國會(huì)[15]、李婧男[16]、Kumar等[17]對甘草、沙冬青、桑樹和四倍體刺槐的研究結(jié)論相同，表明這些物質(zhì)在受鹽脅迫的植物體內(nèi)累積，能有效遏制活性氧含量的上升，保持細(xì)胞內(nèi)活性氧的平衡，避免對膜脂造成傷害，同時(shí)，也顯示了適量的Na+能增強(qiáng)鹽生植物的部分生理功能[18]。

在鹽脅迫下，濱梅扦插苗的生物量隨NaCl處理質(zhì)量濃度升高呈先升后降趨勢，但濱梅扦插苗地上部分和地下部分含水率隨著鹽脅迫質(zhì)量濃度的升高而顯著增加的同時(shí)，根系含水率的增加速率顯著高于地上部分，且遠(yuǎn)高于王利民等[7]研究中對種子苗的報(bào)道。該結(jié)果表明濱梅扦插苗的根系完整性弱于種子苗，在鹽脅迫下根系為保持植株的正常生長所承受的壓力更大，其緩解鹽脅迫壓力的重要方式是根系通過充分的吸水而稀釋體內(nèi)的鹽離子質(zhì)量濃度。經(jīng)2.9 g·L－1質(zhì)量濃度 NaCl處理的濱梅葉MDA質(zhì)量摩爾濃度顯著高于對照，到經(jīng)5.8 g·L－1質(zhì)量濃度NaCl處理的又開始下降，同時(shí)，濱梅葉的SOD、POD 活性經(jīng)5.8 g·L－1質(zhì)量濃度處理的增加明顯，該結(jié)果表明，濱梅的耐鹽是許多酶共同作用的結(jié)果。同時(shí)在鹽脅迫下，正常生長的功能葉片SPAD值在經(jīng)8.8 g·L－1質(zhì)量濃度 NaCl處理 80 d后才顯著降低。Na+濃度隨著鹽脅迫的增強(qiáng)而增加，但增長速率明顯低于土壤鹽分增長率，且在低于8.8 g·L－1質(zhì)量濃度處理下和對照沒有顯著差異，這些結(jié)果表明，濱梅葉片中葉綠素的合成和Na+的積累相關(guān)。

根據(jù)盆栽條件下不同質(zhì)量濃度NaCl處理后濱梅地上部和地下部生物量、形態(tài)特征及生理指標(biāo)變化情況可知，NaCl溶液處理 80 d 后，經(jīng) 2.9 g·L－1以下質(zhì)量濃度處理的濱梅地上和地下部分的生物量增加，經(jīng)5.8 g·L－1質(zhì)量濃度處理的生物量開始下降，但與對照相比無顯著差異，經(jīng)高于8.8 g·L－1鹽質(zhì)量濃度處理下，生長受到明顯抑制;經(jīng)8.8 g·L－1質(zhì)量濃度脅迫40d后超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶、根系活力均與對照差異不顯著，然后經(jīng)8.8 g·L－1或以上質(zhì)量濃度脅迫80 d后均顯著高或低于對照，此時(shí)，葉片SPAD值也開始顯著低于對照。綜合分析認(rèn)為，濱梅對NaCl脅迫具有良好的抗逆能力，在 1.5～5.8 g·L－1質(zhì)量濃度的脅迫下可以正常生長，能短期忍受 8.8 g·L－1以上鹽質(zhì)量濃度的脅迫。這一結(jié)果為進(jìn)一步研究濱梅耐鹽機(jī)理和在沿海灘涂的推廣提供了可靠依據(jù)。

[1]Rieger M.Salt stress resistance of peach and four North American Prunus species[J].Acta Horticulturae，2001，557(7):181－192.

[2]方逵，龔津平，閆道良，等.耐鹽果樹濱梅微繁殖體系的建立[J].南京大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2006，42(5):490－498.

[3]閆道良，王光，方逵，等.濱梅的組織培養(yǎng)和快速繁殖[J].植物生理學(xué)通訊，2006，42(5):921－921.

[4]閆道良，王光，宰學(xué)明，等.乙烯調(diào)節(jié)劑對濱梅離體培養(yǎng)生根的影響[J].林業(yè)科技開發(fā)，2007，21(6):67－70.

[5]付素靜，周玉珍.濱梅的組織培養(yǎng)技術(shù)研究[J].廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，40(8):969－971.

[6]楊靜，陳金林，徐柏森，等.鹽脅迫對美國白蠟和濱梅根系超微結(jié)構(gòu)的影響[J].西南林學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，29(5):23－27.

[7]王利民，陳金林，梁珍海，等.盆栽濱梅幼苗對NaCl脅迫的響應(yīng)[J].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2010，34(3):89－92.

[8]王利民，陳金林，陳菲然，等.鹽分處理對濱梅根際微域營養(yǎng)元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，38(2):30－32.

[9]閆道良，郭予琦，宰學(xué)明，等.不同濃度NaCl對離體培養(yǎng)的濱梅莖段增殖生長和幾種生理指標(biāo)的影響[J].植物生理學(xué)通訊，2008，44(2):273－275.

[10]蘇云松，郭華春，陳伊里.馬鈴薯葉片SPAD值與葉綠素含量及產(chǎn)量的相關(guān)性研究[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2007，20(4):690－693.

[11]李強(qiáng)，文喚成，胡彩榮.土壤pH值的測定國際國內(nèi)方法差異研究[J].土壤，2007，39(3):488－491.

[12]李冬順，楊勁松，周靜.黃淮海平原鹽漬土壤浸提液電導(dǎo)率的測定及其換算[J].土壤通報(bào)，1996，27(6):285－287.

[13]閆道良，王光，方逵，等.耐鹽果樹濱梅的引種及開發(fā)利用[J].林業(yè)科技開發(fā)，2006，20(5):67－69.

[14]吳月燕，李波，張燕忠，等.鹽脅迫對杜鵑生理生化與葉綠體亞顯微結(jié)構(gòu)的影響[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào):農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版，2011，37(6):642－648.

[15]楊國會(huì)，石德成.NaCl脅迫對甘草葉片相對含水量及保護(hù)酶活性的影響[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué) 2009(12):104－106.

[16]李婧男，劉強(qiáng)，賈志寬，等.鹽脅迫對沙冬青幼苗生長與生理特性的影響[J].植物研究，2009，29(5):553－558.

[17]Kumar S G，Reddy A M，Sudhakar C.NaCl effects on proline metabolism in two high yielding genotypes of mulberry(Morus alba L.)with contrasting salt tolerance[J].Plant Science，2003，165(6):1245－1251.

[18]Subbarao G V，Ito O，Berry W L，et al.Sodium-A functional plant nutrient[J].Critical Reviews in Plant Sciences，2003，22(5):391－416.