逄世峰，閆梅霞，孫成賀，王英平

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長(zhǎng)春130112)

蛹蟲(chóng)草(CordycpsmilitarisLink) 又名北冬蟲(chóng)夏草，屬真菌門(mén)、子囊菌亞門(mén)、核菌綱、麥角菌目、麥角菌科、蟲(chóng)草屬，是冬蟲(chóng)夏草的近緣種[1]，是我國(guó)歷史上十分名貴的珍稀、營(yíng)養(yǎng)、滋補(bǔ)、保健及藥用真菌[2-3]。

西洋參在我國(guó)有悠久的藥用歷史,具補(bǔ)虛,安神降壓,益氣生津,祛痰解熱之功效[4]，現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)人參皂苷是其發(fā)揮藥理作用的主要活性成分，其中以人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd含量最高[5]。

微生物發(fā)酵是利用微生物細(xì)胞產(chǎn)生的一種或多種酶將外源底物進(jìn)行催化使其轉(zhuǎn)變成結(jié)構(gòu)相關(guān)的經(jīng)濟(jì)價(jià)值更高的產(chǎn)物[6]。本文首次利用蛹蟲(chóng)草固態(tài)發(fā)酵西洋參，研究蛹蟲(chóng)草固態(tài)發(fā)酵對(duì)西洋參中人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd的轉(zhuǎn)化作用,為藥用植物產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供一種新途徑。

1 儀器、試劑和材料

1.1 儀器

超高效液相色譜儀(waters公司)；電子分析天平(sartorius CPA225D 型)。

1.2 試劑

乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

1.3 材料

蛹蟲(chóng)草(CordycepsmilitarisLink)；西洋參(PanaxquinquefoliumL.)須為干燥須根；人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd(購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所)。

2 方法與結(jié)果

2.1 培養(yǎng)基配制

復(fù)合PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨2g，MgSO42g，K2HPO41.5g，KH2PO41.5g，瓊脂18g，水1000mL。

液體菌種培養(yǎng)基(PDB)：不加瓊脂的復(fù)合PDA培養(yǎng)基配方。

固體發(fā)酵培養(yǎng)基：取5年生干燥西洋參須，截為長(zhǎng)度3～5cm，選用100mL三角瓶，每瓶裝入5g西洋參須，料水比為1g∶2mL，121℃滅菌20min。

2.2 菌種復(fù)壯和液體菌種制作

試管種平板復(fù)壯：將4℃保存的試管種進(jìn)行平板復(fù)壯(22℃，暗培養(yǎng))，復(fù)壯培養(yǎng)基為復(fù)合PDA培養(yǎng)基。

液體菌種制作：用復(fù)壯后菌種制作液體菌種，培養(yǎng)基為液體菌種培養(yǎng)基(PDB)，選用250mL三角瓶，裝液量為130mL/瓶，接種3塊經(jīng)打孔器打孔的平板菌種，搖床培養(yǎng)，180r/min，22℃暗培養(yǎng)7d。

2.3 固體發(fā)酵接種與培養(yǎng)

固體培養(yǎng)基每瓶接種4mL液體菌種，置于23℃黑暗培養(yǎng)，分別于第0、1、2、3、4、6、8、11、14、17、20、23、26、28、31、34、37d取樣。

2.4 人參皂苷含量測(cè)定

2.4.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd對(duì)照品1.00、1.22、1.00、0.97、1.74、1.02、1.54mg，置于10mL容量瓶中，加甲醇適量使其溶解，稀釋至刻度，搖勻即得。

2.4.2 色譜條件[7]

ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1×50 mm，1.7 μm)，流動(dòng)相乙腈-水(梯度洗脫：0～3min，19%～19%乙腈；3～4min，19%～21%乙腈；4～5min，21%～26%乙腈；5～9min，26%～27%；9～12min，27%～32%乙腈；12～15min，32%～43%乙腈)，流速0.5 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm，柱溫35℃，進(jìn)樣量2 μL。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品UPLC色譜圖

2.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

取人參皂苷Rg1、Re、Rg1、Rb2、Rb3、Rc、Rd標(biāo)準(zhǔn)品溶液，加甲醇制成一系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在上述色譜條件下，注入超高效液相色譜儀。以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，回歸方程如下：

Rg1:Y=9.86×105X-1.68×103(R2=0.9993)

Re:Y=1.21×106X +1.57×103(R2=0.9997)

Rg1:Y=6.56×105X-2.11×103(R2=0.9991)

Rc: Y=5.76×105X-1.83×103(R2=0.9996)

Rb2:Y=5.97×105X-2.79×103(R2=0.9996)

Rb3:Y=7.54×105X-1.46×103(R2=0.9990)

Rd:Y=6.61×105X +4.87×103(R2=0.9984)

2.4.4 樣品含量測(cè)定

每個(gè)樣品加入50mL甲醇靜置提取3天，取上清液過(guò)0.22μm微孔濾膜后超高效液相色譜儀測(cè)定。在上述色譜條件下測(cè)定人參皂苷Rg1、Re、Rg1、Rb2、Rb3、Rc、Rd含量，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 蛹蟲(chóng)草固態(tài)發(fā)酵西洋參皂苷含量變化

由圖2可知，在蛹蟲(chóng)草固態(tài)發(fā)酵西洋參基質(zhì)過(guò)程中，本實(shí)驗(yàn)測(cè)定的7種人參皂苷Rg1、Re、Rg1、Rb2、Rb3、Rc、Rd含量均有不同程度的變化。總體來(lái)看，人參皂苷Rg1、Re、Rg1、Rb2、Rc、Rd在接菌后的24h內(nèi)含量明顯降低，Rb3含量升高；Rg1在第1～3天含量先升后降，4～20天含量逐漸降低，20～31天含量變化不大，31～37天含量降低；Rd含量1～26天逐漸升高，26～37天含量降低。

3 討論

隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，本實(shí)驗(yàn)測(cè)定的7種人參皂苷出現(xiàn)不同程度的變化，其中以人參皂苷Rg1和Rd變化最為明顯，第26天人參皂苷Rd含量最高，與第0天相比較，Rd含量增加290.69%，Rg1轉(zhuǎn)化率為84.59%，且Rg1減少量與Rd增加量相當(dāng)，推斷在酶的作用下，人參皂苷Rg1向Rd轉(zhuǎn)化[8]。培養(yǎng)后期，菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)基質(zhì)后，各人參皂苷含量均有不同程度的降低，可見(jiàn)皂苷含量與菌絲生長(zhǎng)狀況密不可分。

總之，蛹蟲(chóng)草菌種所產(chǎn)生的酶系對(duì)人參皂苷具有轉(zhuǎn)化作用，且專(zhuān)一性較好，此方法為人參皂苷Rd的大量制備提供了一種新資源，同時(shí)也為功能產(chǎn)品開(kāi)發(fā)及新藥生產(chǎn)提供了一種新途徑。

[1]胡昭庚.17種藥用真菌栽培[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,1999.

[2]李昊,吳白昌,李春蘭.蟲(chóng)草人工栽培與深度開(kāi)發(fā)[M].北京: 科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社,2003:3-5.

[3]張平,朱述鈞,錢(qián)大順,等.北冬蟲(chóng)夏草功能成分及保健作用分析[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2003(6): 105-107.

[4]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2010:122.

[5]孟祥穎,任躍英,李向高,等.西洋參中皂苷類(lèi)成分的研究綜述[J].特產(chǎn)研究,2001(3):43-46.

[6]孫亮,張美萍,王義,等.人參皂苷生物轉(zhuǎn)化及固體發(fā)酵工藝研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技,2013,32(15):395-399.

[7]張翠英,董,梁,陳士林，等.人參藥材皂苷類(lèi)成分UPLC特征圖譜的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),2010,45 (10):1296-1300.

[8]Li Ye,Chao-Qun Zhou,Wei Zhou,et al.Biotransformation of ginsenoside Rg1to ginsenoside Rd by highly substrate-tolerant Paecilomyces bainier 229-7[J].Bioresource Technology,2010,101: 7872-7876.