彭美蓮

浙江省立同德醫(yī)院婦產科，浙江杭州 310012

隨著經濟的發(fā)展，近年來不孕不育癥的發(fā)生率逐年增高，卵母細胞體外成熟（IVM）是一項新的輔助生殖技術[1]，是指應用少量促性腺激素或者不經過促排卵而直接從卵巢中獲取體內未成熟的卵子，經過適當條件的體外培養(yǎng)，促使卵子成熟并具備受精能力，可以因減少刺激或無刺激而降低常規(guī)體外受精（IVF）中促排卵過程的高額費用，降低常規(guī)促排卵藥物引起的卵巢過度刺激綜合征等不良反應的發(fā)生率[2-3]。1991年人未成熟卵母細胞IVM技術獲得首次成功[4]，此后其發(fā)展一直較為緩慢，而卵母細胞IVM技術的一項重要內容即為IVM培養(yǎng)液，IVM培養(yǎng)液是IVM技術發(fā)展的首要前提。目前臨床使用的培養(yǎng)液大多為在常規(guī)基礎培養(yǎng)液上加入血清等成分，目前還沒有一種價廉、現(xiàn)成、穩(wěn)定和安全的商品化的IVM培養(yǎng)液。本研究中將小鼠各個時期卵母細胞置入不同配方卵母細胞IVM培養(yǎng)液中培養(yǎng)并進行IVF，比較所獲得的卵母成熟率、卵裂率、IVF受精率，研制一種相對穩(wěn)定的改良培養(yǎng)液，通過對IVM培養(yǎng)液成分的干預，改善卵母細胞IVM的條件，為探索輔助生殖新途徑及臨床應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

昆明小鼠50只，普通級，均為健康雌鼠未孕，6～10周齡，體重20 g左右，由中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所實驗動物中心提供，所有小鼠適應性飼養(yǎng)1周，給予光照14 h，暗適應10 h，自由攝食攝水。根據培養(yǎng)液的不同將50只小鼠分為A組和B組，每組各25只。

1.2 IVM培養(yǎng)液的配制

A組：低糖培養(yǎng)基（DMEM），由美國Gibco公司生產；孕馬血清促性腺激素（PMSG），由寧波第二激素廠生產；人絨毛膜促性腺激素（β-HCG）由珠海麗珠生物工程有限公司生產，加入基礎培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)。B組：采用含15%～20%胎牛血清的人類輸卵管液 （HTF）加入基礎培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)（國產杭州四季青）[4]。

1.3 卵母細胞的收集

所有小鼠首先給予10 U PMSG（寧波激素制品廠）腹腔注射，46～48 h后收集卵母細胞。將小鼠斷頸處死后取出卵巢，置于M2操作液沖洗過濾除去脂滴，在顯微鏡下用刺卵針收集卵丘-卵母細胞復合體（COCs），得到小鼠GⅤ期、MⅡ期卵母細胞[5-6]，移入IM液中進行漂洗，再將A、B組移入IVM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.4 卵母細胞的體外培養(yǎng)

在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)[7]，卵母細胞成熟的標志：拆除顆粒細胞后以排出第一極體即為卵母細胞成熟的標志[8]。對體外和體內成熟卵母細胞進行常規(guī)卵胞漿內單精子注射受精。觀察受精12～16 h后原核的形成情況，隨后將受精卵移入GM培養(yǎng)基中，每8小時觀察1次胚胎發(fā)育情況。

1.5 觀察指標及計算方法

①臨床妊娠：指B超下能見到胚囊。②生化妊娠：指發(fā)生在妊娠5周內的早期流產，血中可以檢測到HCG升高，大于25 U/mL或者尿妊娠試驗陽性，但超聲檢查看不到孕囊，提示受精卵著床失敗，又被稱為“亞臨床流產”。③卵裂胚胎評級：1級胚胎：細胞大小均勻，形態(tài)規(guī)則，透明帶完整，胞質均勻清晰，沒有顆?，F(xiàn)象；碎片0%～＜10%之間。2級胚胎：細胞大小略不均勻，形態(tài)略不規(guī)則；胞質可有顆?，F(xiàn)象；碎片10%～＜20%之間。3級胚胎：細胞大小明顯不均勻，可有明顯的形狀不規(guī)則；胞質可有顆?，F(xiàn)象；碎片20%～＜50%之間。4級胚胎：細胞大小嚴重不均勻，胞質可有嚴重顆?，F(xiàn)象；碎片在50%以上。其中1～3級為正常卵裂胚胎。④優(yōu)質胚胎：正常受精來源，第2天為3～5個細胞，第3天為7～9個細胞，碎片≤20%，卵裂球大致均一且無多核、空泡等現(xiàn)象。⑤可移植胚胎：是指發(fā)育良好的正常卵裂胚胎，可以進行移植，為可移植胚胎。其中，正常受精率=（雙原核受精卵數(shù)/成熟卵數(shù)）×100%；優(yōu)質胚胎率=（優(yōu)質胚胎數(shù)/正常卵裂胚胎數(shù)）×100%；卵裂率=（正常卵裂胚胎數(shù)/雙原核受精卵數(shù)）×100%；可移植胚胎率=（可移植胚胎數(shù)/正常卵裂胚胎數(shù)）×100%；胚胎種植率=（胎數(shù)/種植胚胎數(shù)）×100%；妊娠率=[（臨床妊娠周期數(shù)+生化妊娠周期數(shù)）]/種植周期數(shù)×100%；活產率=（活產周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)）×100%[9]。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據分析，計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同發(fā)育階段的卵母細胞

在顯微鏡下（400×）不同發(fā)育階段的卵母細胞的具體發(fā)育情況見圖1。

圖1 不同發(fā)育階段的卵母細胞

2.2 兩種培養(yǎng)液對對卵子成熟及胚胎發(fā)育的影響

A 組小鼠的體外受精率[71.4%（140/196）]、正常受精率[65.7%（92/140）]及卵裂率[89.1（82/92）]與 B 組[67.6%（138/204）、68.1%（94/138）、85.1%（80/94）]比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；A組小鼠的優(yōu)質胚胎率[31.7%（26/82）]和可移植胚胎率[56.1%（46/82）]均優(yōu)于 B 組[25.0%（40/80）、42.5%（34/80）]，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜ 0.05）。 見表 1。

表1 兩種培養(yǎng)液對對卵子成熟及胚胎發(fā)育影響的比較（%）

2.3 兩種培養(yǎng)液對妊娠的影響

A組小鼠的妊娠率為23.3%（21/90），低于B組的32.6%（31/95），兩組間差異有統(tǒng)計學意義（P ＜ 0.05）；但A組小鼠的活產率及胚胎種植率[17.8%（16/90）、66.7%（30/45）]與 B 組[18.9%（18/95）、68.8%（22/32）]比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 兩種培養(yǎng)液對妊娠影響的比較（%）

3 討論

卵母細胞IVM是一項新的輔助生殖技術，其通過體外培養(yǎng)，使卵泡內的未成熟卵母細胞發(fā)育成為成熟的第2次減數(shù)分裂中期（MⅡ）卵母細胞，受精分裂成胚胎并移植獲得妊娠的技術[9-10]。卵母細胞的內在質量是影像卵母細胞IVM的重要因素，卵母細胞的IVM包括核成熟、胞質成熟、胞膜成熟[11]，細胞核完成第一次減數(shù)分離排出的極體即為核成熟，第一極體是判斷核成熟的重要依據。卵母細胞在體內的發(fā)育過程中，胞質成熟和核成熟是同步完成的，卵母細胞體外培養(yǎng)后可恢復減數(shù)分裂并達到MⅡ期，可以受精、發(fā)育為正常胚胎[12]。與體內成熟的卵母細胞相比較，體外培養(yǎng)的卵母細胞可能并不能中分的成熟，卵母細胞的成熟依賴于特定時段特定基因的表達[13]，卵母細胞的成熟受磷酸化/去磷酸化及蛋白質合成/降解等作用的影響[14]。目前關于卵母細胞體外培養(yǎng)的研究較多，但是各個研究報道的結果的差異較大，說明IVM技術尚未完全成熟，仍然需要進一步地改進和完善。雖然有大量的關于人類和哺乳類未成熟卵母細胞IVM的機制和能力的研究[15-16]，但是IVM卵母細胞的妊娠率仍然比常規(guī)的體內成熟卵IVF的妊娠率低，說明IVM技術還有待進一步深入研究。

如何創(chuàng)建適合卵子發(fā)育的體外培養(yǎng)環(huán)境是完善未成熟卵母細胞體外培養(yǎng)系統(tǒng)的關鍵[17]，目前雖然有大量關于人類和哺乳動物卵母細胞IVM的研究[18]，但是其受精后的妊娠率均較低，效果不甚理想，說明卵母細胞細胞質和細胞核的成熟過程在體內是同步進行的，可以進一步闡明哺乳動物卵及胚胎在體外生長代謝時所需的營養(yǎng)條件。人類IVM技術專門針對一些卵子成熟障礙的不孕患者，特別是頑固的多囊卵巢綜合征、卵巢過度刺激征、卵泡發(fā)育遲緩的患者，將此類患者未成熟的卵母細胞取出，在體外進行培養(yǎng)、受精，然后將胚胎移植到母親子宮腔內生長，可能避免藥物和治療的副作用，減少費用，降低促排卵的風險。卵泡的大小和卵丘細胞對卵母細胞的成熟具有重要影響，卵泡的大小在一定程度上反映了卵母細胞的發(fā)育能力，正常的生理狀態(tài)下只有優(yōu)勢卵泡可以排卵，多個動物實驗研究證實，小卵泡中卵母細胞卵裂率和成熟率較低；多層卵丘包裹的卵母細胞的發(fā)育能力較強，卵丘細胞與卵母細胞之間的縫隙連接對卵母細胞的成熟有重要的意義，可能于一些生長因子可以通過兩者的縫隙連接調節(jié)卵母細胞的成熟有關。

培養(yǎng)液是卵母細胞IVM技術發(fā)展的一項重要內容，卵母細胞體外培養(yǎng)基礎培養(yǎng)液有組織培養(yǎng)基（TCM-199）、Ham F10、B2、Eagle 基本 DMEM、HTF 等[19]。體外基礎培養(yǎng)液的選取對卵母細胞成熟率的高低有重要的影響，人類IVM的培養(yǎng)基通常加入一些生長因子、激素或者卵泡液，最常用的是胎兒胚胎血清和臍帶血清[20]。目前關于人類卵母細胞培養(yǎng)基成分的報道少見，可能于GⅤ期卵母細胞的提取難度較大有關。有研究報道顯示[21]，激活素和抑制素也具有促進細胞核成熟和成熟卵母細胞的受精的作用。生長因子、激素或者卵泡液可顯著促進卵母細胞的成熟率和卵裂率。

在IVM培養(yǎng)期間，人類卵母細胞對促性腺激素十分敏感，加入卵泡刺激素（FSH）和黃體生成素能夠促進人類卵母細胞的成熟和卵裂，F(xiàn)SH能夠加速細胞核的成熟，減少染色體異常的發(fā)生。另外，添加生長激素GH可以促進卵泡細胞的增殖，抑制細胞調亡。在培養(yǎng)基中加入5 mmol的視黃醛能夠增加卵裂率，應用抗氧化劑有利胚胎的發(fā)育。但目前還沒有一種現(xiàn)成、價廉、穩(wěn)定和安全的商品化的IVM培養(yǎng)液提供。由此很有必要研制一種改良的IVM培養(yǎng)液并能夠推廣使用。

本研究結果顯示，A組培養(yǎng)液的優(yōu)質胚胎率和可移植胚胎率均優(yōu)于B組，A組小鼠的妊娠率為23.3%，低于B組的32.6%，兩組間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），說明A組所有培養(yǎng)液的應用前景較佳。在卵母細胞的培養(yǎng)過程中，游離卵泡常出現(xiàn)聚集生長現(xiàn)象，抑制卵泡的生長，當較大卵泡在形成腔卵泡而被破壞或退化后，其緊鄰的較小卵泡有些仍可恢復生長發(fā)育能力，繼續(xù)生長，直至形成囊腔，說明卵泡之間存在一種相互作用機制，仍有待于深入研究。

[1]黃荷鳳.現(xiàn)代輔助生育技術[M].北京：人民軍醫(yī)出版社，2003：116.

[2]孫新明，魏泓，趙永聚，等.昆明小鼠成熟卵母細胞體外受精及受精卵體外培養(yǎng)的研究[J].中國比較醫(yī)學雜志，2005，15（3）：129-132.

[3]錢云，師蔚群，丁家桐.哺乳動物體外受精的研究進展[J].動物科學與動物醫(yī)學，2000，17（1）：26-281.

[4]Ebeling S，T?pfer D，Weitzel JM，et al.Bone morphogenetic protein-6 （BMP-6）：mRNA expression and effect on steroidogenesis during in vitro maturation of porcine cumulus oocyte complexes [J].Reprod Fertil Dev，2011，23（8）：1034-1042.

[5]Tahaei LS，Eimani H，Yazdi PE，et al.Effects of retinoic acid on maturation of immature mouse oocytes in the presence and absence of a granulosa cell co-culture system[J].J Assist Reprod Genet，2011，28（6）：553-558.

[6]Li Z，Zhang P，Zhang Z，et al.A co-culture system with preantral follicular granulosa cells in vitro induces meiotic maturation of immature oocytes[J].Histochem Cell Biol，2011，135（5）：513-522.

[7]李媛，姜晶晶，陳子江，等.未成熟卵母細胞評分系統(tǒng)對人類未成熟卵體外成熟及發(fā)育潛能的評價[J].生殖與避孕，2006，26（7）：408-413.

[8]Tkachenko OY，Delimitreva S，Isachenko E，et al.Epidermal growth factor effects on marmoset monkey（Callithrix jacchus）oocytein vitro maturation，IVF and embryo development are altered by gonadotrophin concentration during oocyte maturation[J].Hum Reprod，2010，25（8）：2047-2058.

[9]宣恒華，馮定慶，劉然.干細胞條件培養(yǎng)液促進小鼠卵母細胞體外成熟[J].解剖學雜志，2012，35（3）：272-276.

[10]Asimakopoulos B，Kotanidis L，Nikolettos N.In vitro maturation and fertilization of vitrified immature human oocytes，subsequent vitrification of produced embryos，and embryo transfer after thawing[J].Fertil Steril，2011，95（6）：21-23.

[11]Kim M，Hong SJ，Lee JH，et al.Comparison of in vitro maturation media of immature oocytes：the effectiveness of blastocyst culture media[J].Fertil Steril，2011，95（2）：554-557.

[12]Somfai T，Imai K，Kaneda M，et al.The effect of ovary storage and in vitro maturation on mRNA levels in bovine oocytes；a possible impact of maternal ATP1A1 on blastocyst development in slaughterhouse-derived oocytes[J].J Reprod Dev，2011，57（6）：723-730.

[13]Pereira GR，Lorenzo PL，Carneiro GF，et al.Effect of incubation with different concentrations and durations of FSH for in-vitromaturation of murine oocytes[J].Zygote，2011，23（1）：111-117.

[14]De Vos M，Ortega-Hrepich C，Albuz FK，et al.Clinical outcome of non-hCG-primed oocyte in vitro maturation treatment in patients with polycystic ovaries and polycystic ovary syndrome[J].Fertil Steril，2011，96（4）：860-864.

[15]Vanhoutte L，Nogueira D，De Sutter P.Prematuration of human denuded oocytes in a three-dimensional co-culture system：effects on meiosis progression and developmental competence[J].Hum Reprod，2009，24（3）：658-669.

[16]Leon PM，Campos VF，Kaefer C，et al.Expression of apoptoticgenes in immature and in vitro matured equine oocytesand cumulus cells[J].Zygote，2013，21（3）：279-285.

[17]王輝田，羅光彬，王忠彬，等.兔卵母細胞體外成熟、體外受精及受精卵體外培養(yǎng)條件的研究[J].沈陽農業(yè)大學學報，2013，44（2）：172-177.

[18]梅樹江，林曉潭，王曉梅，等.小鼠腔前卵泡體外培養(yǎng)成熟染色體分析技術的建立[J].癌變·畸變·突變，2009，21（6）：463-466.

[19]Pereira GR，Lorenzo PL，Carneiro GF，et al.The effect of growth hormone （GH）and insulin-like growth factor-I（IGF-I）on in vitro maturation of equine oocytes[J].Zygote，2012，20（4）：353-360.

[20]韋多，謝娟珂，宋小兵，等.未成熟卵母細胞體外成熟培養(yǎng)技術研究進展[J].河南醫(yī)學研究，2011，20（2）：237-240.

[21]Vanhoutte L，Nogueira D，Dumortier F，et al.Assessment of a new in vitro maturation system for mouse and human cumulus-enclosed oocytes：three-dimensional prematuration culture in the presence of a phosphodiesterase 3-inhibitor[J].Human Reproduction，2009，24（8）：1946-1959.

[22]張文紅，朱偉杰，鐘瑜，等.小鼠未成熟卵母細胞體外培養(yǎng)[J].暨南大學學報：自然科學版，2001，22（3）：122-125.