陳廣理 王俊周 郭曉民 楊明

環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2, COX-2)是前列腺素(PGs)合成過(guò)程中主要限速酶, 不僅在炎癥等過(guò)程中發(fā)揮重要作用, 而且還與腫瘤的增生、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［1］。鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是具有極高的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移能力的腫瘤本實(shí)驗(yàn)通過(guò)RT-PCR方法研究在鼻咽癌中COX-2的表達(dá), 探討COX-2在鼻咽癌的增生、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 鼻咽癌及相應(yīng)癌旁組織26例, 來(lái)源于本院鼻咽部活檢標(biāo)本, 其中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例19例、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例7例。癌旁組織取自腫瘤邊緣5 mm以外區(qū)域, 10例正常鼻咽部黏膜組織取于鼻咽部正常的手術(shù)患者。病理學(xué)診斷均為鱗狀細(xì)胞癌, 其中高分化3例、中分化4例、低分化19例。其中男19例, 女7例, 年齡最小27歲, 最大78歲,平均年齡(48.026±5.517)歲, 術(shù)前均未經(jīng)化療或放療。

1.2 主要試劑與儀器 逆轉(zhuǎn)錄酶MLV(MBI), TRIzol試劑(GibCO),dNTP(MBI), TaqDNA聚合酶(MBI), GDS8000型凝膠成像系統(tǒng)(UVP), PTC-200 PCR儀(MJA), Grab-it 4.0分析軟件為Gelworks 1D interdiate, DU650型紫外光分光光度儀(BECKMAN)。

表1 PCR 引物序列和 PCR產(chǎn)物片斷長(zhǎng)度

1.3 引物設(shè)計(jì) 泳道M：Marker；泳道1～2分別是COX-2 mRNA在無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌組織和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移鼻咽癌組織中的PCR產(chǎn)物(236 bp)；泳道3～4分別是COX-2 mRNA在癌旁組織和正常鼻咽部黏膜中的PCR產(chǎn)物(236 bp)。見(jiàn)表1。

1.4 組織RNA提取和cDNA合成 取約50 mg組織放入勻漿器中, 勻漿加入1 ml TRIzol, 用氯仿和異丙醇逐步提取RNA, 溶于焦碳酸二乙脂水中, 然后應(yīng)用紫外分光光度儀檢測(cè)定量。

1.5 RT-PCR反應(yīng) 以cDNA為模板, 擴(kuò)增COX-2 (236 bp)及β-actin (300 bp)等基因片斷。

PCR 反應(yīng)體系為 25 μl, 含上述基因 cDNA 2.0 μl, dNTP 的終濃度0.2 mmol/L, 10×Buffer 2.5 μl, Mg2+的終濃度2.0 mmol/L,TaqDNA聚合酶1 U, 上游和下游引物的終濃度各0.2 μmol/L。β-actin為內(nèi)參照物。

PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min, 95℃ 1 min、50℃1 min、72℃ 1 min, 然后72℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后取5 μl產(chǎn)物電泳, 用grab-It成像系統(tǒng)照像, 然后分析各條帶的積分吸光密度值, 以目的基因與β-actin的相對(duì)積分吸光密度值記錄結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示, 采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 在鼻咽癌組織中COX-2 mRNA高表達(dá), 在正常鼻咽部黏膜中低表達(dá) 本實(shí)驗(yàn)研究表明COX-2 mRNA在全部鼻咽癌組織中高表達(dá), 見(jiàn)圖1, COX-2 mRNA在無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌組織、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移鼻咽癌組織中平均相對(duì)吸光度值分別為：(0.7632±0.0411)和(0.7951±0.0364), 二者之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.371, P>0.05)。

2.2 在鼻咽癌癌旁組織和正常鼻咽部黏膜中COX-2 mRNA低表達(dá), 見(jiàn)圖1, 相對(duì)平均吸光度值分別為：(0.2069±0.0372)、(0.2183±0.0417)。二值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.358, P>0.05)。

圖1 在鼻咽癌組織、癌旁組織和正常鼻咽部黏膜中COX-2 mRNA的表達(dá)

2.3 在鼻咽癌組織中COX-2 mRNA的表達(dá)與在正常鼻咽部黏膜COX-2 mRNA的表達(dá)之間, 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

3 討論

鼻咽癌為我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一, 是極易轉(zhuǎn)移的腫瘤, 通常頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移常為患者最早發(fā)現(xiàn)的體征, 頸部腫塊為此病首發(fā)者約占60%。COX-2在正常組織中不表達(dá)或微量表達(dá), 而在病理情況下, COX-2在炎癥、腫瘤等組織中表達(dá)增高, COX-2的高表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切［1］。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)表明, COX-2在鼻咽癌組織中均高表達(dá), 在癌旁組織和正常鼻咽部黏膜中低表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 鼻咽癌的增長(zhǎng)、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移與COX-2的高表達(dá)有密切的關(guān)系。

3.1 COX-2促進(jìn)腫瘤新生血管的形成血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是促進(jìn)腫瘤新生血管生成的作用最強(qiáng)的因子之一。在腫瘤中高表達(dá)的COX-2可促使VEGF生成增加, COX-2與VEGF協(xié)同作用, 促進(jìn)腫瘤新生血管的生成［2］。文獻(xiàn)報(bào)道,在鼻咽癌中VEGF高表達(dá), 鼻咽癌的失控增殖能力與VEGF的高表達(dá)有密切關(guān)系。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果, 在鼻咽癌組織中COX-2高表達(dá), 表明COX-2與VEGF共同促進(jìn)鼻咽癌新生血管的生成。

3.2 COX-2促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖 在腫瘤中COX-2高表達(dá), 促進(jìn)腫瘤合成大量PGs, 進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖［3］。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果, COX-2在鼻咽癌組織中均高表達(dá), 表明COX-2促進(jìn)了鼻咽癌細(xì)胞的增殖。

3.3 COX-2促進(jìn)腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移 研究表明, 在腫瘤組織中COX-2表達(dá)增高, 同時(shí)有基質(zhì)金屬蛋白酶-2和基質(zhì)金屬蛋白酶-9的表達(dá)升高, E-鈣粘連素的表達(dá)降低, 共同促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。鼻咽癌是具有極高浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移能力的腫瘤, 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, COX-2在鼻咽癌組織中均高表達(dá), 表明COX-2促進(jìn)了鼻咽癌細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。

綜上所述, 鼻咽癌中COX-2表達(dá)升高, 說(shuō)明了鼻咽癌細(xì)胞的增生、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移與COX-2的高表達(dá)有密切關(guān)系。因此,COX-2成為了研究和治療腫瘤的重要靶分子之一, 在抗腫瘤的研究治療中有重要的意義。

［1］Fukazawa EM, Baiocchi G, Soares FA, et al.Cox-2, EGFR, and ERBB-2 Expression in Cervical Intraepithelial Neoplasia and Cervical Cancer Using an Automated Imaging System.Int J Gynecol Pathol, 2014, 33(3):225-234.

［2］Nagoya H, Futagami S, Shimpuku M, et al.Apurinic/apyrimidinic endonuclease-1 is associated with angiogenesis and VEGF production via upregulation of COX-2 expression in esophageal cancer tissues.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2014,306(3):183-190.

［3］Zhao H, Luo F, Li H, et al.Antinociceptive Effect of Tetrandrine on LPS-Induced Hyperalgesia via the Inhibition of IKKβ Phosphorylation and the COX-2/PGE2 Pathway in Mice.PLoS One,2014, 9(4):e94586.