李天平 陳俞先 徐 珽

(四川大學(xué)華西藥學(xué)院，四川 成都 610041)

目前腦缺血尚無有效的治療方法。N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體介導(dǎo)的興奮毒性是缺血性腦損傷發(fā)生的關(guān)鍵機(jī)制之一〔1〕。NR1作為NMDA結(jié)構(gòu)受體，在海馬組織的選擇性表達(dá)是海馬容易發(fā)生缺血性損傷的原因之一〔2〕。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)在保護(hù)局部性腦缺血所誘發(fā)的細(xì)胞壞死凋亡過程中起重要作用。BDNF能夠提高神經(jīng)元的存活率和突觸的可塑性，抑制短暫性腦缺血引發(fā)的細(xì)胞損傷，可以避免局部性腦缺血所產(chǎn)生的海馬CA1區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞壞死凋亡。姜黃素因其具有抗炎、抗氧化的作用〔3〕，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療研究中有重要的地位。有研究〔4〕顯示姜黃素能減輕腦缺血/再灌注(I/R)后神經(jīng)細(xì)胞凋亡,但這是否與減輕興奮性神經(jīng)毒有關(guān)目前尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)考察腦組織海馬神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化及BDNF、NR1 mRNA及蛋白表達(dá)變化，從而進(jìn)一步探索姜黃素抗缺血性腦損傷的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1主要試劑 NR1抗體(Sigma公司)、BDNF抗體(Sigma公司)兔抗鼠二抗(Chemicon公司)、RT-PCR試劑盒(日本Takara)和實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒(日本Takara);姜黃素(美國Sigma公司)。

1.2動(dòng)物模型 18只清潔級沙鼠 10～12周齡，體重275～350 g,由實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物隨機(jī)分成三組:假手術(shù)組(SH)、I/R組、治療組(姜黃素100 mg/kg)。治療組在缺血后給予動(dòng)物100 mg/kg姜黃素腹腔注射，每5 h注射1次。在再灌注3 d后對各組提取樣本。

1.3模型制備 參照Pulsinelli的方法并改進(jìn)，構(gòu)建頸動(dòng)脈雙側(cè)血管阻斷全腦I/R的沙鼠模型。沙鼠經(jīng)水合氯醛麻醉后,分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，用無創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈10 min，重新恢復(fù)血流，縫合皮膚。治療組腹腔注射溶于二甲基亞礬(DMSO)的姜黃素100 mg/kg?？刂剖覝卦?6℃～37℃。使用神經(jīng)功能評分判定全腦I/R造模成功。

1.4神經(jīng)功能評分 再灌注3 d后，對各組沙鼠進(jìn)行Garcia神經(jīng)功能評分。功能正常時(shí)得分最高為18 分，功能損傷越嚴(yán)重越低。

1.5RT-PCR法測定BDNF、NR1 mRNA含量 提取海馬總mRNA，參照試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)時(shí)定量RT-PCR含量標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行定量，檢測海馬NR1 mRNA和BDNF mRNA含量引物序列，見表1。

1.6Western印跡法測定BDNF和NR1的蛋白表達(dá) 沙鼠水合氯醛麻醉，迅速斷頭剝?nèi)『ｑR，加入500 μl RIPA裂解液，超聲勻漿后低溫高速離心，取上清液。BCA法測蛋白濃度，上樣，電泳，一抗(抗NR1，1∶400稀釋； 抗-BDNF，1∶200稀釋；β-actin，1∶5 000稀釋)孵育，二抗1∶5 000稀釋，化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯影。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用Quantity One軟件分析。

2 結(jié) 果

2.1神經(jīng)功能評分 沙鼠在再灌注后開始表現(xiàn)一定程度的行為學(xué)紊亂，3 d后，對各組沙鼠進(jìn)行其Garcia神經(jīng)功能評分。姜黃素治療后，沙鼠評分由8.23±0.59上升到13.32±0.72(P<0.01,n=6)，有顯著療效，SH組為16.5±0.212沙鼠的行為有一定程度的恢復(fù)。

2.2海馬組織NR1、BDNF mRNA表達(dá) I/R組海馬中BDNF mRNA(0.72±0.13)比SH組(0.52±0.04)升高(P<0.05)，而給予100 mg/kg的姜黃素后會(huì)使BDNF mRNA增加到0.96±0.07(P<0.01)。I/R組 NR1 mRNA(0.89±0.05)與SH組(1.56±0.02)相比降低(P<0.05)，而治療組的表達(dá)則是上升到了1.29±0.05(P<0.01)。

2.3海馬組織NR1和BDNF的蛋白表達(dá) 姜黃素使沙鼠腦I/R后海馬組織中的BDNF和NR1的蛋白表達(dá)上調(diào)；I/R組海馬CA1區(qū)BDNF上調(diào)、NR1蛋白下降(P<0.01)。見表2，圖1。

表1 實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測BDNF mRNA和NR1 mRNA表達(dá)的引物序列

表2 NR1、 BDNF蛋白在各組腦海馬組織中的濃度比值

圖1 姜黃素對沙鼠海馬BDNF 和 NR1的蛋白含量的影響

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示：用姜黃素預(yù)處理的沙鼠可以顯著保護(hù)海馬的神經(jīng)元細(xì)胞，并能對沙鼠行為模式產(chǎn)生影響。姜黃素對BDNF和NR1有明顯的調(diào)節(jié)作用。海馬神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)變化和壞死是腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞死亡的主要形式〔6〕。

NMDA的受體蛋白是由必須的結(jié)構(gòu)亞型NMDAR1和調(diào)節(jié)亞型NMDAR2兩種亞單位構(gòu)成的異聚體〔4〕。NR2蛋白與N1蛋白結(jié)合后對其功能及特性起輔助修飾作用，而不能獨(dú)立的發(fā)揮作用。因此,本實(shí)驗(yàn)選擇腦缺血后NR1蛋白表達(dá)的變化來反映NMDAR蛋白在腦I/R后的變化。缺血后胞質(zhì)內(nèi)Ca2+含量的增加是啟動(dòng)細(xì)胞變性凋亡的關(guān)鍵因素,而鈣超載主要由NMDA受體介導(dǎo)〔6〕。BDNF作為腦神經(jīng)營養(yǎng)因子，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的保護(hù)作用不可忽視，研究〔4〕顯示 BDNF可能會(huì)在再灌注后保護(hù)性的增加以減少神經(jīng)元的損傷。有研究表明,姜黃素預(yù)先給藥可減少全腦I/R后腦海馬組織的神經(jīng)細(xì)胞凋亡〔7〕。

I/R作為一個(gè)理想的腦缺血模型，有著重要的研究意義。深入的研究顯示〔8〕，缺血后再灌注4 h后就會(huì)造成腦部損傷至3 d腦損傷的神經(jīng)元細(xì)胞會(huì)達(dá)到最低谷，7 d時(shí)開始恢復(fù)。本次實(shí)驗(yàn)選擇100 mg/kg姜黃素對I/R的腦損傷有保護(hù)作用，是由于姜黃素在體內(nèi)代謝的特性選擇的，有研究〔9〕發(fā)現(xiàn)姜黃素的治療濃度存在范圍，100 mg/kg和300 mg/kg抗缺血神經(jīng)細(xì)胞凋亡效果不如200 mg/kg,這可能與300 mg/kg姜黃素增加NR2B蛋白表達(dá)而啟動(dòng)凋亡信號通路有關(guān)〔10〕。這也提示只有在一定劑量范圍內(nèi)姜黃素才具有抗缺血性神經(jīng)細(xì)胞凋亡效應(yīng)。

總之,預(yù)先給予適量姜黃素能有效減少沙鼠I/R造成的海馬神經(jīng)細(xì)胞變性和壞死,這可能與增強(qiáng)BDNF的保護(hù)機(jī)制和調(diào)節(jié)NR1的雙向調(diào)節(jié)有關(guān); 50～500 mg/kg姜黃素可能為一個(gè)抗缺血性神經(jīng)細(xì)胞變性壞死的有效藥物濃度范圍，這可能與姜黃素在體內(nèi)對肝藥酶的劑量依賴性誘導(dǎo)有關(guān)〔11〕。

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