李秀平，王瑞鵬，年 海，牟英輝

（1國家大豆品種改良中心廣東分中心／華南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，廣東廣州 510642；2廣東農(nóng)工商職業(yè)技術(shù)學院，廣東廣州 510507）

耐鋁根瘤菌的篩選及耐性菌株特性的研究

李秀平1，2，王瑞鵬1，年 海1，牟英輝1

（1國家大豆品種改良中心廣東分中心／華南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，廣東廣州 510642；2廣東農(nóng)工商職業(yè)技術(shù)學院，廣東廣州 510507）

【目的】對我國南方地區(qū)的野生大豆根瘤菌進行耐鋁的篩選，以期建立一套耐鋁根瘤菌篩選和鑒定體系，為南方大豆區(qū)接種高效耐鋁菌株奠定基礎(chǔ).【方法】利用菌株活化培養(yǎng)法分離來自湖南各縣和廣州地區(qū)酸性土壤中的野生大豆根瘤菌株，通過分光光度計進行耐鋁檢測，研究耐性菌株的生長特性以及接種后對栽培大豆的生長和結(jié)瘤的影響.【結(jié)果和結(jié)論】菌株W20能在鋁濃度為200μmol·L-1的培養(yǎng)基上正常生長，而其他菌株的生長則受到較大抑制.菌株W20的最適生長酸度為pH 6.0，致死酸度為pH 4.0.通過質(zhì)子通量試驗發(fā)現(xiàn)，W20的細胞膜能阻止過量的H+進入細胞.在Al3+濃度為200μmol·L-1時，華夏3號接種W20菌株后地上和地下部分生物量分別比對照增加了60.9%和14.8%；瘤數(shù)和瘤質(zhì)量分別提高了66%和209%；地上和地下部分銨態(tài)氮含量分別比對照高25.7%和9.4%.

根瘤菌；酸鋁脅迫；質(zhì)子通量；銨態(tài)氮含量

我國南方酸性土壤的總面積為2.03×107hm2，約占全國土地面積的21%［1］.化肥的大量施用以及酸雨的侵蝕，加劇了土壤酸化的過程［2］.酸性土壤中，Al3+的毒害作用最為明顯.研究發(fā)現(xiàn)我國南方酸鋁土壤中大豆土著菌的數(shù)量都處于一個較低的水平，鋁通過作用于細胞影響微生物的物質(zhì)和能量代謝，抑制微生物的生長和發(fā)育［3-4］.細胞膜是Al3+的作用位點，但其結(jié)合與毒害的作用方式目前還沒有定論［5-6］.Al3+可以通過影響細胞膜的流動性而發(fā)揮其毒害作用［7］.Al3+能引起敏感菌細胞膜中低有序質(zhì)膜區(qū)含量降低；在Al3+誘導條件下，抗性細菌細胞膜中低有序質(zhì)膜區(qū)含量增加，增強了細胞膜流動性［8-9］.Zheng等［10］研究發(fā)現(xiàn)將真菌釀酒酵母菌Saccharomycescerevisiae暴露于高濃度鋁的條件下，可通過活性氧類物質(zhì)（ROS）激活細胞程序性死亡（PCD）誘導細胞死亡［11］.酸鋁對慢生根瘤菌在培養(yǎng)基中生長的限制作用更為明顯.

Wood和Cooper［12］研究表明，當pH為5.5時，三葉草根瘤菌的2株菌HP3和BEL1192增殖速率相同；pH 4.5時BEL1192增殖緩慢；pH小于4.5時，菌株HP3基本不長.在pH為4.5的液體培養(yǎng)基中，Al3+濃度達到50μmol·L-1時，BEL1192菌體數(shù)量急劇下降，而pH 5.5時50μmol·L-1的Al3+就使HP3的菌體數(shù)量急劇下降.50μmol·L-1的Al3+對菌株HP3對數(shù)生長期的毒害作用比延滯期大［12］. Johnson等［13］的研究結(jié)果表明，適當濃度的Al3+能刺激敏感菌株DNA的合成，抗性菌株DNA的合成幾乎不受Al3+的影響.野生大豆作為栽培大豆的祖先，其基因型的多樣性與抗逆能力均好于栽培大豆，接種根瘤菌后對作物的生物量和固氮能力都有明顯的提高［14］.本研究通過對野生大豆根瘤菌進行耐酸鋁篩選，篩選出耐性菌株，并對酸鋁脅迫下菌株的生長特性和接種后的效果進行分析，為南方大豆生產(chǎn)提供有利條件奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 供試材料

大豆Glycinemax品種為華夏3號.菌株W3、W11、W20、W23來自湖南各縣酸性土壤中的野生大豆根瘤，Cl分離自廣州地區(qū)酸性土壤中的栽培大豆根瘤，C2分離自廣州地區(qū)含鎘土壤中的栽培大豆根瘤，C5為模式菌株USDA110，W14為鋁敏感菌株，分離自湖南龍秀.菌株活化培養(yǎng)采用YMA（Yeastmannitol agar）培養(yǎng)基.

1.2 菌株的耐酸鋁篩選

菌株活化培養(yǎng)后，分別接種于鋁濃度為0（對照）、25、50、100、200μmol·L-1的YMA液體培養(yǎng)基中（pH 4.5、V為10 mL），置恒溫振蕩器中（28±1）℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)，3 d后分光光度計測量D600nm（用UV-MINI-1240 220VE型島津紫外分光光度計測定）.每個處理3個重復，并記錄pH.

1.3 致死pH和質(zhì)子通量測定

致死pH：將耐性菌株W20分別轉(zhuǎn)接到pH為3.0、4.0、4.5、5.0、6.0和7.0的YMA液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)和測定方法同1.2，記錄pH.

質(zhì)子通量：將待測菌種在中性培養(yǎng)液中振蕩培養(yǎng)至指數(shù)期中期，經(jīng)離心、洗滌收集活細胞1～3 g（濕質(zhì)量），轉(zhuǎn)入50 mL 0.1 mol·L-1的KCl溶液中制成菌懸液，水浴中保溫［（28±1）℃］并攪拌.用pH儀測定其酸度，待pH穩(wěn)定2 min以上，迅速加入0.05 mol·L-1的HCl，將pH調(diào)至4.0±0.1，并在15 min之內(nèi)每30 s記錄1次pH，重復3次.同樣，將中性培養(yǎng)液培養(yǎng)至指數(shù)期中期的2種菌懸液經(jīng)離心、洗滌收集活細胞1～3 g，轉(zhuǎn)入pH 5.2的培養(yǎng)液中振蕩培養(yǎng)1 h，然后重復上述沖擊方法并測定pH變化，計算質(zhì)子通量.

1.4 回接試驗

大豆種子處理：挑選籽粒飽滿的大豆種子數(shù)粒，先在φ為95%的乙醇溶液中處理3 min，取出后用無菌水沖洗5～6次，放入φ為10%的H2O2溶液浸泡1 min，取出后用無菌水沖洗5～6次，然后埋于經(jīng)120℃高溫滅菌30 min的沙子中，保持一定的濕度，在28℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h.

菌液培養(yǎng)：用接種環(huán)在試管中挑1環(huán)根瘤菌到TY液體培養(yǎng)基中，用膠塞塞好后，放在搖床上培養(yǎng)至對數(shù)生長期（約3～4 d），培養(yǎng)溫度為28℃.

水培箱的制備：將試驗用的塑料桶洗凈，并用φ為0.1%的HCl溶液浸泡24 h，用自來水沖洗2次，再用去離子水沖洗1次，晾干，每桶裝入約5 mL營養(yǎng)液，并用過濾滅菌的AlCl3母液調(diào)配成試驗所需的含鋁營養(yǎng)液.

接種處理：將已催芽的種子放到培養(yǎng)皿中用菌液浸泡15 min，用滅菌棉花固定在帶孔的泡沫板上.移苗后，將水培苗放在光照培養(yǎng)箱（光照度200 mol·m-2·s-1、光照時間12 h）中培養(yǎng)，生長期間定期補充營養(yǎng)液.

2 結(jié)果與分析

2.1 耐鋁菌株的篩選

酸鋁篩選的結(jié)果表明，200μmol·L-1Al3+的脅迫對多數(shù)菌株的生長有較為明顯的抑制作用，抑制程度最大的菌株為W11與W23，其相對生長量分別為15.6%與12.8%，其余菌株的生長在該濃度下也受到不同程度的抑制，僅有菌株W20的生長情況較好，在200μmol·L-1高鋁濃度脅迫下其生長量仍能達到對照（無Al3+處理）的90%，說明菌株W20耐鋁毒的能力要強于其他菌株（表1）.菌株W20的pH隨鋁濃度的增加變化幅度小于其他菌株，除100 μmol·L-1Al3+處理外，在其他濃度的鋁處理下，菌株W20培養(yǎng)基的pH都顯著高于其他培養(yǎng)基，接近中性值（表2）.

表1 不同濃度鋁處理下各菌株的相對生長量1）Tab.1 Relative grow th quantity of strains under different Al3+concentrations %

表2 不同濃度鋁處理下各菌株培養(yǎng)基的pH 1）Tab.2 pH values of strain medium s under different Al3+concentrations

2.2 致死pH的測定

pH為4.0、4.5、5.0、6.0和7.0時菌株W20的D600nm分別為0.01、1.06、1.41、1.67和1.56.在pH≤4.0時，菌株W20的D600nm幾乎不變，說明在該酸度下菌株停止生長，其致死pH為4.0；在pH≥4.5時，菌株W20均能正常生長，且D600nm＞1.0；當pH≥6.0，菌懸液的D600nm＞1.5，同時，菌株W20在pH為6.0環(huán)境中的生長情況要好于在7.0的情況下.

2.3 鋁毒對菌株生長的影響

圖1所示，在48 h之內(nèi)菌株W20生長緩慢，處理與對照之間沒有明顯差別，54 h以后，Al3+的毒害作用開始顯現(xiàn)，對照組的生長速度高于處理組.在濃度為100μmol·L-1的Al3+處理下，菌株的生長速度差異不大，受鋁毒影響差別不明顯.當Al3+達到200 μmol·L-1時，菌株的生長受到影響，66 h后，毒害作用明顯加強.

圖1 W20在不同鋁濃度下的生長曲線Fig.1 Growth curves ofW20 under different Al3+concentrations

2.4 耐性菌株W 20與敏感菌株W 14質(zhì)子通量的變化

未經(jīng)酸處理的菌株W14質(zhì)子通量在6 min達到最大值3.20 nmol·mg-1·min-1，經(jīng)過酸處理后其最大峰值為2.86 nmol·mg-1·min-1，出現(xiàn)在5 min，并且在其后的時間段，質(zhì)子通量幾乎均小于未經(jīng)處理的菌株.經(jīng)誘導和不誘導處理的W20菌株細胞的質(zhì)子通量在大部分時段內(nèi)幾乎為0，W20耐酸菌株對酸誘導并不敏感（圖2）.

2.5 鋁毒對大豆生物量的影響

在Al3+濃度為200μmol·L-1時，華夏3號接種根瘤菌的地上部分生物量比未接種菌株的均降低；接種根瘤菌后，生物量的積累要高于對照.接種W20的植株在無Al3+條件下以及200μmol·L-1Al3+脅迫下，其生物量均高于接種其他菌株的植株，在Al3+濃度為200μmol·L-1時，接種W20的植株生物量比CK增加了60.9%（圖3A）.在無Al3+條件下，華夏3號地下部分的生物量接菌處理的均要高于對照.接種W20的植株地下部分的生物量在200μmol·L-1Al3+脅迫下比未接種植株的高14.8%；接種W14的植株地下部分的生物量在Al3+濃度為200μmol·L-1時，比對照低8.7%（圖3B）.

圖2 酸處理和未經(jīng)酸處理的菌株W20與W14的質(zhì)子通量Fig.2 Proton flux accumulation variation ofW20 and W14 under acid and no acid treatments

圖3 鋁處理后接種根瘤菌對華夏3號生物量的影響Fig.3 Effects of rhizobium on biomass of Huaxia3 under Al3+treatment

2.6 鋁毒對大豆結(jié)瘤的影響

在無Al3+和鋁脅迫下，W20菌株處理的華夏3號的結(jié)瘤個數(shù)均高于其他菌株處理，在Al3+濃度為200μmol·L-1時，接種W20的結(jié)瘤數(shù)比對照增加了66%，瘤質(zhì)量增加了209%.敏感菌株W14在Al3+濃度為200μmol·L-1時接種后結(jié)瘤數(shù)接近于對照，瘤質(zhì)量比對照增加58%（圖4）.

2.7 鋁毒對大豆中銨態(tài)氮含量的影響

接種C5、W20、W14菌后，華夏3號地上部分銨態(tài)氮的質(zhì)量分數(shù)均高于對照，其中耐性菌株W20在Al3+濃度為200μmol·L-1時接種后的銨態(tài)氮質(zhì)量分數(shù)比對照高25.7%.鋁脅迫下地下部分銨態(tài)氮的質(zhì)量分數(shù)普遍低于無Al3+條件，在Al3+濃度為200 μmol·L-1時，接種W20菌株后地下部的銨態(tài)氮質(zhì)量分數(shù)比對照增加了9.4%（圖5）.

圖4 鋁處理后接種根瘤菌對華夏3號結(jié)瘤的影響Fig.4 Effects of rhizobium on nodulation of Huaxia3 under Al3+treatment

圖5 鋁處理后接種根瘤菌對華夏3號氮含量的影響Fig.5 Effects of rhizobiumoncontent of Huaxia3 under Al3+treatment

3 討論與結(jié)論

本研究對實驗室長期保存的7株根瘤菌的耐酸鋁能力進行了研究，其中4株分離自野生大豆，3株分離自栽培大豆.研究結(jié)果表明，大部分的菌株都能在濃度0～200μmol·L-1的鋁脅迫下生長，隨著鋁濃度的升高，菌株的生長受到抑制.在200μmol·L-1鋁處理時，多數(shù)根瘤菌的生長量受到明顯抑制，僅有W20的生長受到影響的程度較低，因此，我們篩選出具有耐鋁特性的菌株W20.在酸性條件下（pH＜5），鋁主要以A13+的形式存在，這種形態(tài)的鋁對生物的危害最為明顯.Illmer和Schinner［15］認為Al3+和ATP形成穩(wěn)定的復合物，并且抑制了細胞內(nèi)的能量流動，尤其對質(zhì)膜上的ATPase的影響尤為明顯.本研究結(jié)果表明，Al3+對菌株的生長影響始于48 h，說明Al3+影響菌株W20的代謝活動.

在酸性條件下，細胞內(nèi)的pH下降程度越低，胞內(nèi)的可溶性鋁含量也會降低，可溶性鋁與核酸的磷酸基團相結(jié)合被抑制，進而影響細胞的分裂［16］.有研究表明耐酸與耐鋁特性可能存在一定的相關(guān)性，在耐酸的根瘤菌資源中，可能存在耐鋁性強的菌株［17-20］.本研究結(jié)果表明，菌株W20經(jīng)過酸誘導后具有較強的抵御H+的能力，而菌株W14在經(jīng)過酸誘導后對H+的抵御能力明顯地降低，這可能是因為細胞膜在受到酸處理后抗拒H+能力不同引起的.在酸性200μmol·L-1鋁脅迫條件下接種菌株W20明顯地提高了華夏3號大豆地上部、地下部的生物量，增加了結(jié)瘤數(shù)量，促進了植株體內(nèi)氮的含量.本研究通過對野生大豆根瘤菌進行耐酸鋁篩選，篩選出耐性菌株W20，并對其在酸鋁脅迫下的菌株生長特性和接種后的效果進行了分析，為華南酸鋁性紅壤地區(qū)種植大豆高產(chǎn)技術(shù)提供了理論基礎(chǔ)和試驗依據(jù).

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【責任編輯周志紅】

Screening for Al-tolerant rhizobium and a study on its characters

LIXiuping1，2，WANG Ruipeng1，NIAN Hai1，MU Yinghui1
（1 Guangdong Sub-center of National Soybean Improvement Center／College of Agriculture，South China Agriculture University，Guangzhou 510642，China；2 Guangdong AIB Polytechnic College，Guangzhou 510507，China）

【Objective】The resistant aluminium strains of wild soybean rhizobia in Southern China were screened to set up a system of isolating and identifying aluminum-tolerant rhizobium，and to establish the foundation of effective inoculant for soybean planting areas in South China.【Method】The nodules of wild soybean which grew in Hunan Province and Guangzhou areawere isolated by using technique of strains activated culturemethod.The tolerance of aluminum was detected by spectrophotometer.The growth characteristics of aluminum-tolerant rhizobium were analyzed using themethod of inoculation.The effects on growth and nodulation of the cultivated-soybean were explored by inoculatingwith aluminum-tolerant strains.【Result and conclusion】The results showed that the isolated rhizobium could grow with 200μmol·L-1Al3+distinct from the other strains，showing some special features of tolerance to aluminum.The boundary pH thatW20 could not survive was 4.0，while the favorite pH was 6.0.In the Proton flux assay，W20 had the ability to preventmore H+from penetrating the cytomembrane than W14，which could makeW20 avoid some damage caused by H+.Inoculating with the effective rhizobium could significantly increase soybean biomass，nodulation，N content and reduce the content of Al3+with aluminum addition.The shoot and root biomass of soybean increased by 60.9%and 14.8%respectively，while the nodule num-ber and nodule weight increased by 66%and 209%with the rhizobium ofW20 strain inoculants at 200 μmol·L-1Al3+，respectively.Meanwhile NH4-N content of shoot and root was stimulated by 25.7% and 9.4%respectively.

rhizobium；acid and aluminum-tolerant；proton flux assay；NH4-N content

S565.1

A

1001-411X（2014）04-0050-06

2014-01-06優(yōu)先出版時間：2014-06-03

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http:∥www.cnki.net／kcms／doi／10.7671／j.issn.1001-411X.2014.04.010.html

李秀平（1971—），女，講師，博士，E-mail:lxpyx2008＠163.com；通信作者:牟英輝（1975—），男，副教授，博士，E-mail:youhymoon＠scau.edu.cn

國家自然科學基金（31371642，31171508）；亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室開放課題（SKL-CUSA-2013-08）

李秀平，王瑞鵬，年 海，等.耐鋁根瘤菌的篩選及耐性菌株特性的研究［J］.華南農(nóng)業(yè)大學學報，2014，35（4）：50-55.