劉曉莉LIU Xiao-li

（延安大學化學與化工學院，延安716000）

0 引言

膠原蛋白是哺乳動物中含量十分豐富的一種蛋白，它的類型、質(zhì)量以及分布的改變直接影響著動物體正常的機能，具有非常重要的生物學機能，也是非常重要的蛋白質(zhì)。

膠原蛋白由于其良好的生物相容性和弱抗原性而可廣泛使用于醫(yī)藥、醫(yī)用材料及美容化妝品行業(yè)[1]。目前所用的動物源膠原蛋白具有病毒隱患及理化性能差的缺點。本文主要研究如何將人源性膠原蛋白的mRNA逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，再經(jīng)過酶切并修飾后進行特定序列重復，轉(zhuǎn)導于大腸桿菌內(nèi)，經(jīng)過高密度發(fā)酵，使外源基因大量表達，從而得到水溶性的類人膠原蛋白（human-like collagen）。類人膠原蛋白不僅具有膠原蛋白原有的功效，而且經(jīng)修飾后的三重復螺旋結(jié)構(gòu)賦予其在分子量不變的條件下優(yōu)于天然膠原蛋白的獨特的化學結(jié)構(gòu)和更新的功能，如可逆成膠性、無病毒隱患、可加工性、低免疫排異性、水溶性等性質(zhì)，消除了從動物身上提取的膠原蛋白的缺陷，大大拓展了其用途。

利用重組大腸桿菌E.coli his 3.1表達重組蛋白質(zhì)，代謝副產(chǎn)物乙酸積累的量對菌體生長、目標產(chǎn)物的表達都有較大的影響。隨著乙酸積累達到一定程度，菌體的生長和產(chǎn)物合成會逐漸停止。乙酸對細胞生長代謝的抑制機理現(xiàn)在比較公認的為：乙酸在中性pH環(huán)境中以離子化（CH3COO-）和質(zhì)子化（CH3COOH）兩種形式存在，質(zhì)子化的乙酸具有弱的親脂性，可以穿過細胞質(zhì)膜進入胞內(nèi)，在胞內(nèi)（pH 7.5）解離成CH3COO-和H+，這樣就降低了膜內(nèi)pH值，使膜內(nèi)外pH差減小，減弱了質(zhì)子推動力，產(chǎn)生的能量大大減少，擾亂了細胞的正常代謝和生理活性[5]。

乙酸的產(chǎn)生與細胞中的電子傳遞鏈和三羧酸循環(huán)有關(guān)。已知的大腸桿菌產(chǎn)生乙酸途徑有兩條，一是在丙酮酸氧化酶的作用下由丙酮酸直接生成乙酸。二是在乙酸激酶（ACK）和磷酸轉(zhuǎn)乙酰基酶（PTA）作用下由乙酰CoA生成乙酸。前者由于丙酮酸氧化酶在大腸桿菌中活性較低，不足以產(chǎn)生大量乙酸，因此后一條途徑就成為乙酸產(chǎn)生的主要途徑[4]。

當碳氮比過高時，就會造成碳代謝流在糖酵解途徑中的過量，細胞為了平衡碳代謝流，就要釋放出部分代謝副產(chǎn)物，而乙酸就是其中的主要副產(chǎn)物。

在低水平溶氧條件下，細胞由于攝氧量不足以滿足其好氧呼吸而轉(zhuǎn)向厭氧代謝，產(chǎn)生乙酸等小分子有機酸。

另外，在比生長速率過高條件下，大腸桿菌通過氧化代謝作用產(chǎn)生的能量不足以滿足合成和異化的需求，必須通過乙酸生成途徑獲得ATP和NADPH2。細胞在生成一分子乙酸同時，也會生成一分子ATP，這就成了乙酸產(chǎn)生的優(yōu)勢所在。

本實驗主要研究大腸桿菌生產(chǎn)類人膠原蛋白在補料—分批培養(yǎng)下乙酸的產(chǎn)生規(guī)律以及乙酸對類人膠原蛋白產(chǎn)量的影響，并對其進行優(yōu)化。

1 實驗部分

1.1 材料與方法

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 基因工程菌E.coli his 3.1，卡那抗性，溫度誘導，質(zhì)粒pNWCP31。

1.1.2 種子培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基用固體LB培養(yǎng)基和液體LB培養(yǎng)基。從LB平板上分別刮取兩個單菌落，分別置于兩個盛有50mL種子培養(yǎng)基的300mL的搖瓶中，在溫度為32°C，轉(zhuǎn)速為200rpm的搖床中培養(yǎng)10～12h，然后將此種子轉(zhuǎn)接于八個盛有50mL種子培養(yǎng)基的300mL的搖瓶中，在相同的條件下培養(yǎng)10～12h。

1.1.3 分批-補料培養(yǎng) 將已經(jīng)培養(yǎng)好的種子接種到裝有6L發(fā)酵培養(yǎng)基的12.8L發(fā)酵罐中，控制溫度在34°C。在分批-補料培養(yǎng)階段，通過調(diào)節(jié)空氣流量、提高攪拌轉(zhuǎn)速和罐壓控制DO在20%空氣飽和度，用25%氨水（w/w）自動調(diào)節(jié)pH值為6.8。當發(fā)酵罐中的葡萄糖耗盡時，采用近指數(shù)補料法控制比生長速率[7]。當OD600達到90～100時，升溫至42°C開始誘導，兩小時后降溫至39°C，繼續(xù)誘導6～8h。

發(fā)酵培養(yǎng)基和補料培養(yǎng)基成分見表1。

表1 培養(yǎng)基的組成

1.1.4 主要試劑 酵母提取物為Oxoid公司生產(chǎn)；卡納霉素為Siga公司生產(chǎn)；其它為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 分析方法

1.2.1 乙酸含量（HPLC法）

1.2.1.1 HPLC系統(tǒng) 高效液相色譜儀Shim-pack VP-ODS，色譜柱（150mm×4.6mm），紫外檢測波長 210nm，流速1ml/min，進樣5μl，流動相，乙腈：磷酸鹽緩沖液（pH2.6）=3.5：96.5，A相為超純水，B相為色譜純的甲醇。

1.2.1.2 流動相的選擇依據(jù) 決定流動相的pH值的主要成分是被分離的有機酸pKa值乙酸的解離常數(shù)是4.76，柱子的pH值的最小下限是2，在流動相是酸性環(huán)境中，如果允許乙酸有1%的離子狀態(tài)存在，則可預測流動相的pH值：

即流動相的pH值應(yīng)該是pH2～2.76之間，我們選定pH值為2.6，用磷酸鹽作為緩沖液。

1.2.1.3 流動相的配制

①溶液A：用磷酸鹽緩沖液（H3PO4+KH2PO4）將超純水調(diào)節(jié)pH至2.6。

②流動相：乙腈：溶液A=3.5：96.5。

③將配好的流動相置于溶劑過濾器中過濾，然后在超聲波清洗器下進行超氣。

1.2.1.4 樣品預處理

①取1ml發(fā)酵液10，000r/min離心5min；

②取上清 0.5ml，加入 0.3gNaCl，0.10mL 2.3mol/L H2SO4，2.50mL 乙醚，在振蕩器上混合 1mim,5，000r/min 離心3min；

③取乙醚相1.00mL，加0.20mL 0.1mol/LNaCl混合1min,5，000r/min離心3min,吸去上層乙醚，用試紙測試pH＞9（在酸性條件下，用乙醚萃取，將有機酸以分子形式萃取到乙醚相中，再在pH＞9的條件下反萃取到水相中，可大大去除其他物質(zhì)的干擾），開蓋揮發(fā)乙醚相后，置干燥器內(nèi)干燥；

④加入0.40mL 0.05mol/L（NH4）H2PO4（pH2.6）溶解，10，000r/min 離心 10min；

⑤取5μl進樣分析。

1.2.1.5 保留時間的確定 選取發(fā)酵液中可能產(chǎn)生的有機酸如甲酸，琥珀酸，乙酸，檸檬酸，酒石酸，各取2%標準溶液進樣分析，測定各有機酸的保留時間分別為：甲酸1.99min，琥珀酸 2.215min，乙酸 2.880min，檸檬酸 3.011min，酒石酸 3.751min。

圖1 標準乙酸色譜圖

1.2.1.6 乙酸標準曲線的繪制 精確量取分析純的冰醋酸配制成含有 0g/L，0.2g/L，0.4g/L，0.6g/L，1.0g/Lm1.4g/L，2.0g/L不同濃度的標準乙酸溶液，分別取5μl進樣分析。

用乙酸濃度（X）對峰高（Y）做線性回歸分析，

得到線性方程 Y=463.8X

線性相關(guān)系數(shù) R2=0.9633

圖2 乙酸標準曲線

1.2.1.7 進樣分析 取 0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22h時段的培養(yǎng)液，按樣品處理方法進行樣品處理后，進行HPLC測定，得到培養(yǎng)過程中乙酸隨發(fā)酵過程的變化曲線。

1.2.2 產(chǎn)物表達量的測定（雙縮脲法）

1.2.2.1 試劑 雙縮脲試劑：1.75g（CuSO4·5H2O）溶于150mL蒸餾水，加入300mL的濃氨水、300mL的冰蒸餾水及200mL的飽和NaOH搖勻，置于室溫1～2小時。用蒸餾水定容至1000mL。標準蛋白質(zhì)溶液：10mg·mL-1牛血清白蛋白溶液。

1.2.2.2 蛋白質(zhì)標準曲線的制定 取10支試管，按表2-3順序操作，在分光光度計（540nm）上測定吸收度。

其中，Y為標準曲線查得蛋白質(zhì)的濃度（mg·mL-1），N為稀釋倍數(shù)，V為樣品所取的體積（mL）。

表2 雙縮脲標準曲線制作

2 結(jié)果與分析

2.1 乙酸對細胞生長的影響

2.1.1 乙酸隨發(fā)酵過程的曲線圖

圖3 樣品乙酸色譜圖

在發(fā)酵過程中乙酸的含量（HPLC測得的峰高表示）及糖含量如表3所示。

表3

由表3經(jīng)換算可得乙酸的含量，制得乙酸隨發(fā)酵由成圖（圖4）。

圖4 乙酸隨發(fā)酵由成圖

大腸桿菌在發(fā)酵過程中，碳源供給量高于細胞所同化的速度，因此當生長速率過大的時候，就會使得供氧不足，導致代謝副產(chǎn)物乙酸的形成。尤其發(fā)酵條件在高密度的時候，問題更加突出。在進行培養(yǎng)基中葡萄糖的濃度過于影響著細菌的代謝方式，隨著葡萄糖濃度的降低，大腸桿菌將乙酸作為碳源，發(fā)酵液中的乙酸濃度降低；隨著葡萄糖濃度的增加，發(fā)酵液中的乙酸濃度迅速增加，pH值迅速下降，從而導致對大腸桿菌繁殖和膠原蛋白表達的抑制。

2.1.2 乙酸對細胞生長的影響

由圖5可以發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵初期，乙酸含量低，不會對細胞的生長產(chǎn)生抑制，比生長速率大；隨著細胞的生長，細胞利用葡萄糖作為碳源進行代謝，產(chǎn)生大量乙酸，比生長速率有下降的趨勢；隨著葡萄糖的消耗，此時補糖尚未開始，菌體利用乙酸作為碳源進行代謝，乙酸含量降低，比生長速率保持平穩(wěn)；從第10小時開始補糖，隨著發(fā)酵地進行，乙酸逐漸積累，濃度升高，菌體的比生長速率降低；在發(fā)酵進行到第14個小時的時候，進行溫度誘導，比生長速率增加，乙酸積累，濃度增加；隨著發(fā)酵地進行，菌體已經(jīng)進入衰亡期，最后葡萄糖用盡，發(fā)酵停止。

圖5 乙酸與細胞生長的關(guān)系

2.2 乙酸對類人膠原蛋白合成的影響

由圖6、7可以看出，當乙酸含量低時，不會對類人膠原蛋白的產(chǎn)量有影響，隨著乙酸積累，會對產(chǎn)量產(chǎn)生影響，當乙酸含量達到一定程度，產(chǎn)物合成會逐漸停止。

圖6 乙酸對產(chǎn)量的影響1

圖7 乙酸對產(chǎn)量的影響2

所以應(yīng)該考察在不同碳氮比，不同細胞比生長速率，不同溶氧下條件下乙酸產(chǎn)生的量和其對目標蛋白表達量的影響，以確定生產(chǎn)類人膠原蛋白的優(yōu)化條件。

3 小結(jié)

本文主要是對人類膠原蛋白基因工程菌E.coli his 3.1高密度發(fā)酵過程中乙酸的產(chǎn)生量和產(chǎn)物表達量之間的關(guān)系進行討論研究。我們可以看出，溶解氧控制在30～40%飽和度、比生長速率控制在0.1～0.2h-1、碳氮比控制在100：1到100：20左右的時候，有利于細胞生長和產(chǎn)物的表達，這樣能夠與降低乙酸等有害代謝副產(chǎn)物的積累有著直接的關(guān)系，可使最終表達量為9g/L，占總蛋白的30.5%。

[1]關(guān)靜,武繼民.膠原蛋白的醫(yī)療應(yīng)用[J].軍事醫(yī)學科學院院刊,1997,21（4）：305-308.

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