朱琳艷 張蓉

(1.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部，江蘇蘇州 215123；2.上海市奉賢區(qū)中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海 201499)

卵巢癌是目前病死率最高的婦科惡性腫瘤。約75%的卵巢癌患者確診時已為晚期，而Ⅲ期和Ⅳ期卵巢癌患者的5年生存率不足45%[1]?；熓峭砥诼殉舶┑闹饕委熓侄沃弧＆?輔肌動蛋白4(alpha-actinin 4，ACTN4)是一種纖維狀肌動蛋白(F-actin)交聯(lián)蛋白，是血影蛋白超家族成員之一，可參與細胞骨架重組、細胞形態(tài)變化、胞質(zhì)分裂及細胞黏附，并促進腫瘤細胞的遷移及侵襲[2]。本研究以ACTN4高表達的卵巢癌細胞株(SKOV3和OVCA429)為研究對象，探究體外沉默ACTN4表達對卵巢癌細胞的增殖、凋亡及化療敏感性的影響及其可能的機制。

1 資料與方法

1.1 主要試劑 胎牛血清(FBS)購自美國HyClone公司，RPMI-1640和McCoy’s 5A培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司，青鏈霉素混合液(青霉素的含量為10 kU/mL，鏈霉素的含量為10 mg/mL)購自北京索萊寶生物科技有限公司，紫杉醇購自美國Sigma公司，轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine TM 2000購自美國Invitrogen公司，real-time PCR試劑盒購自丹麥DBI公司，蛋白裂解液(RIPA)購自上海碧云天生物技術(shù)研究所，Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人卵巢漿液性乳頭狀囊腺癌細胞株SKOV3及人卵巢漿液性癌細胞株OVCA429細胞均購自美國ATCC細胞庫。SKOV3細胞采用含10% FBS的McCoy’s 5A培養(yǎng)基，OVCA429細胞采用含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，均置于37℃、體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 靶向ACTN4基因的ACTN4-siRNA的設(shè)計與合成 靶向ACTN4基因的干擾序列 正義鏈：5′-GAUGGUAUGGACGAUGAACTT-3′，反義鏈：5′-GUUCAUCGUCCAUACCAUCTT-3′。另設(shè)計一條無義序列作為陰性對照siRNA，正義鏈：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，反義鏈：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。siRNA均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。

1.2.3 ACTN4-siRNA瞬時轉(zhuǎn)染SKOV3/OVCA 429細胞 按轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine TM 2000說明書進行細胞轉(zhuǎn)染，取對數(shù)生長期的SKOV3/OVCA429細胞(5×105/孔)，接種到6孔細胞培養(yǎng)板中，24 h后細胞融合至30%～50%時進行轉(zhuǎn)染。將ACTN4-siRNA寡聚物100 pmol加至100 μL Opti-MEM無血清無抗生素的培養(yǎng)基中輕輕混勻，室溫放置5 min；再加入5.0 μL Lipofectamine TM 2000，輕輕混勻后，室溫下孵育5 min；將上述混合物加到培養(yǎng)板中，再補加900 μL無抗生素完全培養(yǎng)基，37℃、體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱孵育6 h后換完全培養(yǎng)基。每種細胞實驗組別設(shè)置均為：未轉(zhuǎn)染組(空白組)、陰性對照組(對照組，轉(zhuǎn)染Ctrl-siRNA)和ACTN4-siRNA轉(zhuǎn)染組(轉(zhuǎn)染組，轉(zhuǎn)染ACTN4-siRNA)

1.2.4 Real-time PCR檢測ACTN4 mRNA的表達 提取卵巢癌細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并擴增目的片段。ACTN4基因引物序列：上游引物5′ -GCAGCATGGGCGACTACAT-3′，下游引物5′-TTGAGCCCGTCTCGGAAGT -3′。內(nèi)參18s RNA 基因引物序列：上游引物5′ -TGCGAGTACTCAACACCAACA-3′，下游引物5′- GCATATCTTCGGCCCACA-3′。PCR擴增條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40個循環(huán)。以2-△△ct值表示ACTN4 mRNA的相對表達量。

1.2.5 Western blotting檢測相關(guān)蛋白的表達 收集轉(zhuǎn)染后48 h的各組細胞，提取總蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒定量并計算蛋白濃度。蛋白樣品經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，TBST(Trisbuffered saline with Tween)洗滌3次，滴加一抗(兔抗人ACTN4多克隆抗體1∶2000稀釋，兔抗人AKT/p-AKT、Src/p-Src、FAK/p-FAK、Bax、Bad、Bid、 Bim、Bcl-2、GAPDH多克隆抗體為1∶1000稀釋)，4 ℃孵育過夜后，用TBST洗膜，滴加二抗(鼠抗兔熒光二抗，1∶10000稀釋)，室溫孵育2 h，洗膜，以GAPDH作為內(nèi)參照。采用ImageJ軟件分析圖像，以ACTN4蛋白條帶與GAPDH蛋白條帶密度積分的比值表示ACTN4蛋白水平。

1.2.6 MTT法檢測轉(zhuǎn)染后細胞的增殖能力 收集轉(zhuǎn)染48 h后的各組細胞，按2000個/孔的細胞密度接種到4塊96孔板中，每種細胞接種5個復(fù)孔。每天取1塊板，加入含有10% MTT的培養(yǎng)液100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)細胞4 h后棄去培養(yǎng)液，每孔加入100 μL二甲基亞砜(DMSO)，溶解藍紫色結(jié)晶甲瓚；震蕩后用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔細胞在490 nm處的吸光值(OD值),并繪制細胞增殖曲線。

1.2.7 MTT法檢測轉(zhuǎn)染后細胞的存活率 取對數(shù)生長期的細胞，按5000個/孔的細胞密度接種于96孔板中，轉(zhuǎn)染后24 h棄去培養(yǎng)基，按濃度梯度(0、5、10、20、40、80 nmol/L)加入紫杉醇，每組設(shè)5個復(fù)孔；加入紫杉醇48 h后棄去培養(yǎng)液，進行MTT試驗，檢測OD值(方法同1.2.6)，計算細胞抑制率及存活率，并繪制細胞存活率曲線。細胞抑制率(%)=(陰性對照組OD值-轉(zhuǎn)染組OD值)/(陰性對照組OD值-空白組OD值)×100%，細胞存活率(%)=100%-細胞抑制率(%)。

1.2.8 流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后細胞的凋亡情況 收集轉(zhuǎn)染后的細胞，PBS洗3次，按照Annexin V-FITC和PI雙染試劑盒說明書用流式細胞術(shù)檢測細胞的凋亡情況，用未染色的細胞調(diào)零，以Annexin V-FITC和PI單染管作為基準(zhǔn)，獲取參數(shù)并分析，計算凋亡細胞的百分比。

2 結(jié) 果

2.1 轉(zhuǎn)染ACTN4-siRNA可下調(diào)SKOV3/OVCA429細胞中ACTN4基因的表達 real-time PCR及Western blotting結(jié)果顯示，ACTN4-siRNA轉(zhuǎn)染高表達ACTN4的SKOV3/OVCA429細胞后，ACTN4 mRNA表達水平分別下調(diào)了82.4%、73.9%；蛋白表達水平分別下調(diào)86.7%、78.2%。與空白組相比，陰性組Ctrl-siRNA-SKOV3/OVCA429中ACTN4 mRNA的表達無明顯變化(P>0.05)見圖1。

2.2 轉(zhuǎn)染ACTN4-siRNA對SKOV3/OVCA429細胞增殖能力的抑制作用 MTT結(jié)果提示，SKOV3細胞的轉(zhuǎn)染組與對照組第1天OD值差異無統(tǒng)計學(xué)意義；第2天對照組和轉(zhuǎn)染組OD值分別為1.28±0.10和0.87±0.07，第3天的OD值分別為1.68±0.13和1.18±0.07，兩組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01 ) 。OVCA429細胞轉(zhuǎn)染組與對照組在第1天OD值分別為0.59±0.05和0.43±0.05，第2天OD值分別為1.04±0.10和0.63±0.09，第3天OD值分別為1.40±0.12和0.99±0.08；兩組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 ACTN4-siRNA轉(zhuǎn)染可增加SKOV3/OVCA 429細胞對紫杉醇的敏感性 MTT結(jié)果顯示，ACTN4-siRNA和Ctrl-siRNA分別轉(zhuǎn)染SKOV3/OVCA429細胞，然后用不同濃度紫杉醇處理，48 h后用酶聯(lián)免疫檢測儀測定490nm波長處吸光度值并計算不同濃度紫杉醇處理的細胞存活率。兩種細胞的結(jié)果一致，與對照組相比，轉(zhuǎn)染組細胞存活率均較低，轉(zhuǎn)染組對紫杉醇的敏感性明顯增加(P<0.01，圖2A、B)。各組細胞存活率數(shù)值詳見表1。

2.4 ACTN4-siRNA轉(zhuǎn)染可促進SKOV3和OVCA429細胞的凋亡 瞬時轉(zhuǎn)染ACTN4-siRNA 48 h后，采用流式細胞術(shù)檢測SKOV3/OVCA429細胞的凋亡率，結(jié)果顯示，SKOV3細胞轉(zhuǎn)染組凋亡率[(7.22±0.31)%]明顯高于對照組[(2.07±0.08)%]；OVCA429細胞轉(zhuǎn)染組凋亡率[(23.37±0.18)%]明顯高于對照組[(19.49±0.19)%]，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

A：卵巢癌細胞中ACTN4的表達情況；B、C ：SKOV3/OVCA429中ACTN4的mRNA表達情況；D、E：Western blotting檢測SKOV3/OVCA429中ACTN4的表達情況

表1 各轉(zhuǎn)染組的SKOV3/OVCA429細胞在不同濃度紫杉醇作用下的細胞存活率 (%)

圖2 轉(zhuǎn)染ACTN4-siRNA可增加卵巢癌細胞SKOV3/OVCA429對紫杉醇的化療敏感性

2.5 ACTN4-siRNA轉(zhuǎn)染后SKOV3/OVCA429細胞中凋亡相關(guān)基因的蛋白表達 Western blotting檢測轉(zhuǎn)染ACTN4-siRNA后SKOV3/OVCA429細胞中凋亡相關(guān)蛋白分子的表達，結(jié)果顯示，沉默ACTN4基因后，p-Akt、p-FAK蛋白表達明顯降低(圖4A)，凋亡抑制蛋白Bcl-2表達水平明顯降低，促凋亡蛋白Bid和Bim表達水平明顯升高，見圖4B。

圖3 轉(zhuǎn)染ACTN4-siRNA可促進卵巢癌細胞SKOV3/OVCA429的凋亡

圖4 轉(zhuǎn)染ACTN4-siRNA后SKOV3/OVCA429細胞中凋亡相關(guān)基因的蛋白表達水平

3 討 論

目前，卵巢癌的早期診斷及判斷復(fù)發(fā)的主要標(biāo)志物為CA125，但其靈敏度和特異度均不滿意，因此尋找新的卵巢癌標(biāo)志物十分重要[2]。我們前期通過分析TCGA數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，ACTN4在卵巢癌患者中表達上調(diào)，且ACTN4基因與卵巢癌患者的預(yù)后相關(guān)。

雖然目前臨床上80%的卵巢癌患者首次化療時對紫杉醇敏感，但大部分復(fù)發(fā)患者再次化療時對紫杉醇的敏感性大大降低。本研究中，特異性干擾ACTN4表達后，卵巢癌細胞增殖的能力明顯減弱，卵巢癌細胞對紫杉醇的敏感性顯著增加。本研究發(fā)現(xiàn)，干擾ACTN4表達后，卵巢癌細胞的凋亡率明顯升高，提示ACTN4可能通過抑制細胞凋亡而參與化療耐藥。

Bansal等[3]發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞對化療藥物的敏感性與凋亡抑制蛋白家族Bcl-2的表達密切相關(guān)，其中Bcl-2家族中的Bad蛋白與上皮性卵巢癌細胞對順鉑耐藥有關(guān)。Yousif[4]發(fā)現(xiàn)，抑制FAK的表達可降低p-PI3K/p-Akt的表達水平；Dent等[5]證實，卵巢癌中PI3K/Akt的活化與腫瘤的惡性行為及抗凋亡密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，干擾ACTN4的表達后，p-Akt/p-FAK表達降低，凋亡抑制蛋白Bcl-2表達降低，促凋亡蛋白Bid和Bim表達升高，這提示，ACTN4可能通過激活FAK-PI3K/Akt通路促進卵巢癌細胞凋亡，從而抵抗化療。

綜上所述，ACTN4可能通過激活FAK-PI3K/Akt信號通路抑制Bcl-2家族蛋白的表達，促進Bid和Bim的表達，從而誘導(dǎo)卵巢癌細胞的凋亡。干擾ACTN4的表達可增加卵巢癌細胞對紫杉醇敏感性，有望改善卵巢癌患者的預(yù)后。

[1]Pliarchopoulou K, Pectasides D.Epithelial ovarian cancer: focus on targeted therapy [J].Crit Rev Oncol Hematol,2011,79(1):17-23.

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[5]Dent P, Grant S, Fisher PB, et al.PI3K: A rational target for ovarian cancer therapy? [J].Cancer Biol Ther,2009,8(1):27-30.