段曉燕 冷雪芹 陳平 蘇秉忠 孫涓 牛麗麗 胡香珍 常鴻菲

近年來(lái)我國(guó)結(jié)直腸癌發(fā)病和死亡率均呈上升趨勢(shì)[1]，發(fā)病率和病死率均高于世界平均水平[2]。腸息肉的發(fā)病率隨年齡增加而上升，約有30%的人在一生中會(huì)有腸息肉形成。二者發(fā)病的病因尚不十分清楚，其發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中細(xì)胞凋亡基因和抑癌基因異常表達(dá)是目前研究的熱點(diǎn)。端粒酶(telomerase)使細(xì)胞具有無(wú)限增殖的能力，具有抑制細(xì)胞凋亡的作用。人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reversetranscriptase，hTERT)作為端粒酶的主要限速成份，其表達(dá)的強(qiáng)度與端粒酶活性一致，因此，hTERT的表達(dá)可以作為衡量端粒酶活性的指標(biāo)[3]。PTEN是在1997年被發(fā)現(xiàn)的新的抑癌基因，它是第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白的同源基因[4]。研究顯示，PTEN在人類(lèi)腫瘤的發(fā)生與發(fā)展中扮演著極其重要的角色[5]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫組織化學(xué)法(SP法)檢測(cè)端粒酶、PTEN在結(jié)直腸癌、癌旁組織、結(jié)直腸息肉、息肉旁正常組織中的表達(dá)，并探討端粒酶、PTEN在大腸癌及大腸息肉發(fā)生過(guò)程中的作用及兩者之間的關(guān)系，進(jìn)一步研究端粒酶及PTEN與腫瘤進(jìn)展和預(yù)后的關(guān)系。

材料與方法

一、一般資料

收集內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科及普通外科2012年10月至20l3年10月門(mén)診及住院患者83例，其中68例大腸息肉、25例息肉旁正常組織、15例結(jié)直腸癌灶組織(其中10例患者有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，5例患者無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)、9例癌旁組織。又根據(jù)Morson結(jié)直腸息肉分類(lèi)方法分類(lèi)，炎性息肉17例，增生性息肉16例，腺瘤35例，其中管狀腺瘤12例，絨毛狀腺瘤11例，混合型腺瘤l2例。臨床資料分類(lèi)：?jiǎn)伟l(fā)25例，多發(fā)(≥2個(gè))43例；直徑≤0.5cm的35例，直徑在0.5～1cm之間的有18例，直徑≥1cm的15例；根據(jù)息肉部位，升結(jié)腸5例，橫結(jié)腸15例，降結(jié)腸13例，乙狀結(jié)腸24例，直腸11例。對(duì)照組正常大腸黏膜標(biāo)本取自息肉旁正常組織并HE染色病理證實(shí)為正常大腸黏膜，共25例。我們排除了家族遺傳性大腸癌疾病的患者、錯(cuò)構(gòu)瘤性息肉(常染色體顯性遺傳性疾病)患者、最近6個(gè)月內(nèi)服用活血藥物的患者。我們也排除了雖經(jīng)病理證實(shí)為大腸息肉但同時(shí)檢出患有大腸癌的患者。以上所有診斷均經(jīng)病理檢查證實(shí)。

二、試劑與方法

采用免疫組織化學(xué)S-P法，即鏈霉素抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶法檢測(cè)大腸癌、大腸息肉組織中端粒酶和PTEN的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。(抗原修復(fù)均采用微波修復(fù))，即用型PTEN兔抗人多克隆抗體、即用型端粒酶兔抗人多克隆抗體均購(gòu)于北京博奧森有限公司。即用型S-P免疫組化染色試劑盒、濃縮型DAB顯色試劑盒均購(gòu)于福建邁新有限公司。采用PBS液代替一抗作為陰性對(duì)照，采用已知的陽(yáng)性片作為陽(yáng)性對(duì)照。

三、結(jié)果判定方法

端粒酶陽(yáng)性表達(dá)主要定位于胞核或胞質(zhì)，PTEN陽(yáng)性表達(dá)主要定位于細(xì)胞的細(xì)胞漿或細(xì)胞膜中，陽(yáng)性結(jié)果呈黃色、棕黃色或者褐色的細(xì)小顆粒。我們?cè)?0×40倍視野下觀察切片，隨機(jī)選取合適的10個(gè)視野，計(jì)算出視野中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。按陽(yáng)性細(xì)胞所占視野細(xì)胞的百分比分級(jí)：視野中無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為陰性(-)：視野中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)少于20%為弱陽(yáng)性(+)；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)20%～50%為中度陽(yáng)性(++)；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在50%以上記為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)；一個(gè)加號(hào)以上為陽(yáng)性結(jié)果。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用χ2檢驗(yàn)、Fisher確切概率法和Spearman相關(guān)系數(shù)分析。相關(guān)性用相關(guān)系數(shù)r表示。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、大腸癌及大腸息肉中端粒酶和PTEN的表達(dá)結(jié)果

端粒酶在大腸癌組織中的陽(yáng)性率(80.00%)顯著高于癌旁組織(22.22%)、大腸息肉組織(19.12%)和正常大腸黏膜組織(0.00%)。在息肉的不同類(lèi)型中，腺瘤中端粒酶的表達(dá)(34.29%)顯著高于增生性息肉(0.00%)及炎性息肉(5.88%)。端粒酶在腺瘤中的陽(yáng)性表達(dá)率為：絨毛狀腺瘤72.73%、混合型腺瘤16.67%、管狀腺瘤16.67%。以上差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 端粒酶和PTEN在大腸癌、大腸息肉中的表達(dá)情況表

注：a圖為息肉旁組織PTEN表達(dá)免疫組織化學(xué)S-P法染色圖像(400ד+++”)；b圖為息肉旁組織端粒酶表達(dá)免疫組織化學(xué)S-P法染色圖像(400ד-”)；c圖為大腸癌中PTEN表達(dá)免疫組織化學(xué)S-P法染色圖像(400ד-”)；d圖為大腸癌中端粒酶表達(dá)免疫組織化學(xué)S-P法染色圖像(400ד+++”)；e圖為絨毛狀腺瘤PTEN表達(dá)免疫組織化學(xué)S-P法染色圖像(400ד-”)；f圖為絨毛狀腺瘤端粒酶表達(dá)免疫組織化學(xué)S-P法染色圖像(400ד+++”)；g圖為管狀腺瘤PTEN表達(dá)免疫組織化學(xué)S-P法染色圖像(400ד-”)；h圖為管狀腺瘤端粒酶表達(dá)免疫組織化學(xué)S-P法染色圖像(400ד++”)；i圖為PTEN在增生性息肉中表達(dá)免疫組織化學(xué)S-P法染色圖像(400ד+”)；j圖為端粒酶在增生性息肉表達(dá)免疫組織化學(xué)S-P法染色圖像(400ד++”)；k圖為PTEN在炎性息肉中表達(dá)免疫組織化學(xué)S-P法染色圖像(400ד+++”)；l圖為端粒酶在炎性息肉中表達(dá)免疫組織化學(xué)S-P法染色圖像(400ד++”)

PTEN在大腸癌組織中的陽(yáng)性率(20.00%)顯著低于癌旁組織(77.78%)、大腸息肉組織(54.41%)和正常大腸黏膜組織(80.00%)。兩兩比較中，大腸癌組織與癌旁組織間，大腸癌與大腸息肉組織間，息肉組織與息肉旁組織間，大腸癌與息肉旁正常組織間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，在結(jié)直腸息肉旁組織與結(jié)直腸癌旁組織間的差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表1)(圖1)。

二、不同病理類(lèi)型息肉組織中的表達(dá)情況

1.端粒酶的表達(dá)：端粒酶在腺瘤性息肉中的表達(dá)率為34.29%(12/35)明顯高于增生性息肉0%(0/16)及炎性息肉5.88%(1/17)。三者之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，兩兩比較增生性息肉、腺瘤間，炎性息肉、腺瘤間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。增生性息肉、炎性息肉間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表2)。

2.PTEN的表達(dá)：PTEN在腺瘤性息肉為40.00%(14/35)顯著低于增生性息肉62.50%(10/16)及炎性息肉76.47(13/17)，三者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，在兩兩比較中炎性息肉和腺瘤間有顯著差異(P<0.05)。增生性息肉、腺瘤間，增生性息肉和炎性息肉間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表2)。

表2 端粒酶和PTEN在不同病理類(lèi)型息肉中的表達(dá)情況表

表3 端粒酶和PTEN在不同病理類(lèi)型腺瘤的表達(dá)情況表

三、不同病理類(lèi)型的腺瘤中端粒酶和PTEN的表達(dá)情況

1.端粒酶的表達(dá)：端粒酶在絨毛狀腺瘤中的陽(yáng)性率為72.73%、混合型腺瘤16.67%、管狀腺瘤16.67%。三者之間有差異(P<0.05)。絨毛狀腺瘤和管狀腺瘤間，絨毛狀腺瘤與混合性腺瘤間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)?；旌闲韵倭雠c管狀腺瘤間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表3)

2.PTEN的表達(dá)：PTEN在絨毛狀腺瘤中陽(yáng)性表達(dá)率為9.09%(1/11)，在混合型腺瘤中的陽(yáng)性表達(dá)率為50%(6/12)，在管狀腺瘤中的陽(yáng)性表達(dá)率為58.33%(7/12)。三者之間有差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表3)。

四、大腸癌、大腸息肉中端粒酶與PTEN表達(dá)的相關(guān)性

在大腸癌組織中，端粒酶與PTEN成負(fù)相關(guān)關(guān)系，Spearman相關(guān)系數(shù)：r=-0.516，P<0.05。在大腸息肉組織中，端粒酶與PTEN成負(fù)相關(guān)關(guān)系，Spearman相關(guān)系數(shù)：r=-0.261，P<0.05。

五、大腸癌和息肉相關(guān)因素與端粒酶、PTEN表達(dá)的關(guān)系

端粒酶和PTEN的表達(dá)與大腸癌有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切(r=0.560，P<0.05；r=-0.707，P<0.05，表4)。端粒酶與息肉大小(r=0.262，P<0.05)關(guān)系密切，與息肉發(fā)生的部位及數(shù)量沒(méi)有明顯相關(guān)性(P>0.05)，PTEN表達(dá)與息肉大小、部位、息肉數(shù)量沒(méi)有相關(guān)性(表5)。

表4 端粒酶、PTEN與大腸癌有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系情況表

表5 不同部位的息肉及大小、是否多發(fā)與端粒酶、PTEN表達(dá)關(guān)系情況表

討 論

研究發(fā)現(xiàn)，正常體細(xì)胞中幾乎檢測(cè)不到端粒酶活性，而多數(shù)腫瘤細(xì)胞中端粒酶活性異常升高[6]，有研究發(fā)現(xiàn)，15%以上的癌前病變中也可以檢測(cè)到端粒酶活性[7]。PTEN基因在人類(lèi)腫瘤的產(chǎn)生、發(fā)展中起重要作用，有望成為新的基因治療靶點(diǎn)。它在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制有：(1)負(fù)性調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路[8]。PI3K/AKT信號(hào)通路的激活可負(fù)性調(diào)控細(xì)胞增殖和分化[9]。(2)對(duì)細(xì)胞周期的抑制作用。(3)PTEN具有抑制FAK/P130C和MAPK信號(hào)通路的作用。(4)PTEN抑制新生血管生成，增強(qiáng)其抑癌作用[10]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PTEN在大腸癌組織中的表達(dá)顯著低于癌旁組織、大腸息肉組織和息肉旁組織，可能說(shuō)明PTEN與大腸息肉的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系。PTEN在腺瘤性息肉中的表達(dá)顯著低于增生性息肉及炎性息肉，可能提示PTEN的缺失在息肉異型增生至息肉癌變過(guò)程起重要作用。PTEN在絨毛狀腺瘤中的表達(dá)顯著低于混合型腺瘤及管狀腺瘤。PTEN隨腺瘤中絨毛含量的增多而表現(xiàn)出逐漸缺失的趨勢(shì)，與目前所認(rèn)為的腺瘤絨毛含量越多越容易惡變的觀點(diǎn)相符合。綜上所述，端粒酶在大腸癌、大腸息肉中的表達(dá)較息肉旁組織明顯增高，且與息肉的不同類(lèi)型有關(guān)系，提示端粒酶可能在大腸癌前病變至大腸癌的進(jìn)展過(guò)程中起作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)端粒酶的表達(dá)與大腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)關(guān)系，提示端粒酶可以做為腫瘤進(jìn)展程度的術(shù)前評(píng)估指標(biāo)。

目前有些學(xué)者對(duì)腫瘤細(xì)胞中端粒酶和PTEN表達(dá)的相關(guān)性做了研究[11-12]，研究?jī)煞N因子在腫瘤產(chǎn)生、發(fā)展及復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、預(yù)后的作用，為患者在治療方案上的選擇及預(yù)后判斷提供參考。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染野生型PTEN基因也能夠抑制腫瘤細(xì)胞端粒酶活性[13]?？紤]到腫瘤侵襲特性與端粒酶活性有密切關(guān)系，而PTEN抑癌基因具有抗侵襲作用，PTEN基因是否有抑制腫瘤增殖和端粒酶活性作用呢？有實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，外源性PTEN抑癌基因?qū)敫咿D(zhuǎn)移性黏液表皮樣癌細(xì)胞能夠誘導(dǎo)癌細(xì)胞增殖抑制，并且導(dǎo)致端粒酶活性顯著下降[14]。文獻(xiàn)報(bào)道PTEN抑癌基因抑制端粒酶活性的機(jī)制可能是通過(guò)抑制PKB活化，下調(diào)端粒酶關(guān)鍵組分hTERT mRNA水平，進(jìn)而導(dǎo)致端粒酶活性降低[15]。由此可見(jiàn)，端粒酶和PTEN的表達(dá)存在著相互制約和影響的關(guān)系，PTEN表達(dá)減低或缺失致使端粒酶表達(dá)增高；反過(guò)來(lái)，端粒酶的表達(dá)增高時(shí)在某種程度上也影響了PTEN的表達(dá)。

在我們的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，PTEN在大腸癌中的表達(dá)缺失，在腺瘤性息肉表現(xiàn)出缺失傾向，并隨著腺瘤病理類(lèi)型的不同而有差別。端粒酶和PTEN在大腸息肉的表達(dá)可能存在一定的相關(guān)性。聯(lián)合檢測(cè)對(duì)大腸癌、癌前病變的診斷、治療及預(yù)后有重要意義。目前研究已證實(shí)端粒酶抑制劑可與腫瘤的放、化療協(xié)同，增加其治療的敏感性[16-18]。也可將端粒酶的核心成員hTERT作為靶點(diǎn)，進(jìn)行腫瘤免疫治療研究[19]。如誘導(dǎo)hTERT特異性T淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)，尤其是細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)效應(yīng)，特異性清除hTERT陽(yáng)性的腫瘤細(xì)[20]。相信不久的將來(lái)抑制端粒酶藥物及PTEN基因的替代療法會(huì)應(yīng)用于臨床，用于大腸息肉、大腸癌的預(yù)防和治療。

[1] 陳瓊，劉志才，程蘭平，等.2003～2007年中國(guó)結(jié)直腸癌發(fā)病與死亡分析.中國(guó)腫瘤，2012，21(3)：179-182.

[2] Ferlay J，Shin HR，Bray F，et al.Estimates of worldwide burden of cancer in 2008：GLOBOCAN 2008.Int J Cancer，2010，127(12)：2893-2917.

[3] Shay JW，Wright W E.Role of telomeres and telomerase in cancer.Semin Cancer Biol，2011，21(6)：349-353.

[4] Xuehua Zhu，Xia Qin，MaoguiFei，et al.Combined Phosphatase and Tensin Homolog(PTEN)Loss and Fatty Acid Synthase(FAS)Overexpression Worsens the Prognosis of Chinese Patients with Hepatocellular Carcinoma.Int J MolSci，2012，13：9980-9991.

[5] Hollander MC，Blumenthal GM，Dennis PA.PTEN loss in the continuum of common cancers，rare syndromes and mouse models.Nat Rev Cancer，2011，11(4)：289-301.

[6] Cifuentes-Rojas C，Shippen DE.Telomerase regulation.MutatRes，2012，730(1-2)：20-27.

[7] Meeker AK，DeMarzo AM.Recent advances in telomere biology：implications for human cancer.CurrOpinOnco，2004，16(1)：32-38.

[8] Roy S，Yu Y，Padhye SB，etal.Difluorinated-curcumin(CDF)restores PTEN expression in colon cancer cells by down-regulating miR-21.See comment in PubMed Commons below.PLoS One，2013，8(7)：68543.

[9] Song MS，Salmena L，Pandolfi PP.The functions and regulation of the PTEN tumour suppressor.Nat Rev Mol Cell Biol，2012，13(5)：283-296.

[10] Kamaljeet Singh，Rochelle A Simon，Cunxian Zhang，etal.“Surface epithelial changes”in uterine endometrioid carcinoma mimicking micropapillary serous borderline tumor of ovary：report of two cases and review of the literature.Diagnostic Pathology，2011，6：13.

[11] Furnari FB，Huang SH，CaveneeWK.Thephosphoinsitol phosphatase activity of PTEN mediates a serum-sensitive G1growth arrest in gliomdcells.Cancer Res，1998，58(22)：5002-5008.

[12] 尤永平，傅震，趙鵬，等.反義hTERT/PTEN聯(lián)合基因治療惡性膠質(zhì)瘤的體內(nèi)外研究.中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，2006，12(23)：605-609.

[13] Zhou C，Bae-Jump VL，Whang YE，et al.The PTEN tumor suppressor inhibits telomerase activity in endometrial cancer cells by decreasing hTERT mRNA levels.GynecolOncol，2006，101(2)：305-310.

[14] 劉斌，吳軍正，關(guān)素敏，等.PTEN基因聯(lián)合多西環(huán)素抑制黏液表皮樣癌細(xì)胞系端粒酶活性的研究.華西口腔醫(yī)學(xué)雜志，2010，28(5)：532-534.

[15] Kokubo Y，Gemma A，Noro R，et al.Reduction of PTEN protein and loss of epidermal growth factor receptor gene mutation in lung cancer with natural resistance to gefitinib(IRESSA).Br J Cancer，2005，92(9)：1711-1719.

[16] 董俊紅，王振明，付新華，等.RNAi沉默survivin表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞凋亡及紫杉醇敏感性的影響.腫瘤防治研究，2010，37(3)：266-269.

[17] Alli E，Yang JM，F(xiàn)ord JM，et al.Reversal of Stathmin-Mediated resistance to paclitaxel and vinblastine in human breast carcinoma cells.MolPharmacol，2007，71(5)：1233-1240.

[18] Tan J，Zhou X，Zhu H.hTERT-siRNA Could Potentiate the Cyto-toxic Effect of Gemcitabine to Pancreatic Cancer Cells Bxpc-3.ExpClin Transplant，2012，10(4)：386-393.

[19] Tajima K，Ito Y，Demachi A，et al.Interferon-gamma differentially regulates susceptibility of lung cancer cells to telomerase specific cytotoxic T lymphocytes.Int J Cancer，2004，110(3)：403-412.

[20] Pesonen S，Diaconu I，Kangasniemi L，et al.Oncolytic immunotherapy of advanced solid tumors with a CD40L-expressing replicating adenovirus：assessment of safety and immunologic responses in patients.Cancer Res，2012，72(7)：1621-1631.