楊正多 張丹 呂宏程 張麗 劉光 馬卉 王剛 張?jiān)娢?/p>

結(jié)直腸癌是人類常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)病率居第四位[1]。腫瘤易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移而療效較差，因此探討與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的分子生物學(xué)機(jī)制對(duì)其早期診斷、早期治療及預(yù)后至關(guān)重要。細(xì)胞周期調(diào)控是腫瘤研究的熱點(diǎn)之一，細(xì)胞周期相關(guān)蛋白調(diào)節(jié)失控與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Stathmin蛋白是一種微管不穩(wěn)定蛋白，主要通過(guò)磷酸化和去磷酸化作用來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞微管系統(tǒng)的動(dòng)力學(xué)平衡與穩(wěn)定，控制細(xì)胞周期并調(diào)節(jié)細(xì)胞生物學(xué)行為[2]。Stathmin在人體正常組織中幾乎不表達(dá)，但在多種惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，如乳腺癌[3]、結(jié)直腸癌[4]、肺癌[5]、喉鱗狀細(xì)胞癌[6]、內(nèi)分泌腫瘤[7]和卵巢癌[8]等，其表達(dá)水平的高低對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展及患者生存預(yù)后有重要影響。組織蛋白酶(Cathepsin)是位于溶酶體內(nèi)的一種半胱氨酸蛋白酶超家族，其活性與相應(yīng)前體蛋白的剪切密切相關(guān)。Cathepsin B是該蛋白酶超家族的重要成員之一，其重要的生物學(xué)功能之一是作為淀粉樣前體蛋白分泌酶參與淀粉樣前體蛋白的分解加工，與阿爾茲海默病的發(fā)生具有密切關(guān)系[9-10]。Cathepsin B還可能介導(dǎo)了一條非caspase的凋亡通路，調(diào)控腫瘤細(xì)胞發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移等過(guò)程。近年來(lái)大量科研報(bào)道表明Cathepsin B與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，包括乳腺癌[11]，食管癌[12]，子宮內(nèi)膜癌[13]以及結(jié)直腸癌[14]等。本文利用158例結(jié)直腸癌患者的臨床病理切除標(biāo)本及64例轉(zhuǎn)移灶的石蠟包埋組織制成組織芯片，利用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)二者的表達(dá)及其與腫瘤臨床病理分級(jí)間的聯(lián)系，為探討結(jié)直腸癌患者臨床病理分級(jí)的有用指標(biāo)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

材料和方法

一、一般資料

收集南開(kāi)大學(xué)人民醫(yī)院病理科2009年-2013年手術(shù)切除、臨床病理資料完整的結(jié)直腸癌組織存檔蠟塊158例及64例轉(zhuǎn)移灶組織(發(fā)病年齡20歲-86歲，中位年齡61歲)，所有患者術(shù)前均未接受放射、化學(xué)藥物等抗腫瘤治療。按照WHO分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)結(jié)直腸癌病例進(jìn)行組織學(xué)分級(jí)和TNM分期。

二、試劑和方法

濃縮型兔抗人Cathepsin B多克隆抗體(clone：BA-0428，1：50，Boster Tec.，Wuhan)；即用型兔抗人Stathmin單克隆抗體(clone：RMA-0641，Maixin Bio，F(xiàn)uzhou),抗鼠或兔即用型免疫組化Maxvision二抗(Kit-5020,Maixin Bio.，F(xiàn)uzhou)。DAB顯色系統(tǒng)購(gòu)自北京中杉金橋生物公司。免疫組織化學(xué)染色采用S-P二步法，均采用檸檬酸鈉緩沖液(0.01 M,pH=6.0)高溫高壓修復(fù)，PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

復(fù)查HE染色切片，用定位器對(duì)蠟塊上具有代表性的組織區(qū)域進(jìn)行定位標(biāo)記，每例組織選擇2-3個(gè)位點(diǎn)；使用全自動(dòng)組織芯片制備儀制作每個(gè)位點(diǎn)直徑為1.5 mm的組織芯片，4 um厚連續(xù)切片，分別行HE染色和免疫組化檢測(cè)。

三、結(jié)果判定

高分化及中分化結(jié)直腸癌組織中Stathmin和Cathepsin B以細(xì)胞膜和/或細(xì)胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性，低分化結(jié)直腸癌組織中Stathmin和Cathepsin B以細(xì)胞膜和/或細(xì)胞漿以及細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性，光鏡下觀察陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量，采用染色指數(shù)計(jì)數(shù)法。每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野(×400)，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)以上腫瘤細(xì)胞。根據(jù)腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性個(gè)數(shù)和染色強(qiáng)度綜合評(píng)價(jià)免疫組化結(jié)果。染色強(qiáng)度方面，腫瘤細(xì)胞胞漿或胞核無(wú)明顯染色計(jì)1分，染成淺黃色計(jì)2分，深棕黃色計(jì)3分；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)方面：陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞數(shù)<25%，計(jì)0分；陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞數(shù)≥25%且<50%，計(jì)1分；陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞數(shù)為≥50%且<75%，計(jì)2分；陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞數(shù)≥75%，計(jì)3分。染色指數(shù)為染色強(qiáng)度和染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)乘積。乘積≥4者為陽(yáng)性，0～3為陰性[15]。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，采用四格表確切概率法及Pearsonχ2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

Stathmin蛋白陽(yáng)性信號(hào)主要位于細(xì)胞膜和/或細(xì)胞質(zhì)(圖1a～c)。Stathmin蛋白在高分化結(jié)直腸組織中表達(dá)陽(yáng)性率為53.8%，在中分化腫瘤組織中表達(dá)陽(yáng)性率為56.4%，在低分化腫瘤組織中表達(dá)陽(yáng)性率為64.7%，差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.369，P=0.504)。在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移灶中，Stathmin蛋白在高分化組織中表達(dá)陽(yáng)性率為14.3%，在中分化腫瘤組織中表達(dá)陽(yáng)性率為22.2%，在低分化腫瘤組織中表達(dá)陽(yáng)性率為56.4%，差異具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(分別為χ2=4.212，P=0.040和χ2=5.803，P=0.016，圖2)。Stathmin蛋白在低分化結(jié)直腸癌細(xì)胞核陽(yáng)性表達(dá)(圖1d)。

Cathepsin B蛋白陽(yáng)性信號(hào)主要位于細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)(圖1e～g)。Cathepsin B蛋白在高分化結(jié)直腸組織中表達(dá)陽(yáng)性率為39.2%，在中分化腫瘤組織中表達(dá)陽(yáng)性率為83.6%，在低分化腫瘤組織中表達(dá)陽(yáng)性率為90.4%，差異具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(分別為χ2=22.223，P=0.000和χ2=29.651，P=0.001)。在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移灶中，Cathepsin B蛋白在高分化組織中表達(dá)陽(yáng)性率為85.7%，在中分化腫瘤組織中表達(dá)陽(yáng)性率為83.3%，在低分化腫瘤組織中表達(dá)陽(yáng)性率為74.4%，差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.845，P=0.655，圖3)。Cathepsin B蛋白在低分化結(jié)直腸癌細(xì)胞核陽(yáng)性表達(dá)(圖1h)。

討 論

目前關(guān)于細(xì)胞周期及其調(diào)控機(jī)制在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用的研究已經(jīng)取得很大進(jìn)步，細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)失控與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。細(xì)胞周期蛋白(cyclins)、周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase，CDKs)以及周期蛋白依賴性激酶抑制物(CDK-inhibitors，CDKIs)對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行著嚴(yán)格調(diào)控。Stathmin蛋白是一種重要的微管解聚蛋白，在細(xì)胞周期的不同階段通過(guò)磷酸化和去磷酸化來(lái)促進(jìn)微管的解聚或阻止微管的聚合，Stathmin磷酸化水平與微管的平衡狀態(tài)及細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)換密切相關(guān)[16]。在細(xì)胞外基質(zhì)中，磷酸化可以降低Stathmin的活性，因此，降低Stathmin磷酸化的點(diǎn)突變可以減弱細(xì)胞外基質(zhì)的穩(wěn)定性，增加腫瘤細(xì)胞侵襲能力[17]，提示Stathmin在腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用。Stathmin蛋白的高表達(dá)對(duì)腫瘤細(xì)胞的遷移和腫瘤患者生存預(yù)后都有重要影響。因此，Stathmin可能成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)。

Belletti等[18]研究結(jié)果顯示Stathmin蛋白的過(guò)表達(dá)可促進(jìn)軟組織肉瘤細(xì)胞發(fā)生局部組織浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。Singer等[19]報(bào)道稱在非小細(xì)胞肺癌中，Stathmin過(guò)表達(dá)可以加快腫瘤細(xì)胞分裂增殖和基質(zhì)浸潤(rùn)，增加細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)。Zheng等[4]研究結(jié)果表明結(jié)直腸癌患者中Stathmin均高表達(dá)，并且發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移的患者中Stathmin表達(dá)水平更高，發(fā)生轉(zhuǎn)移和未轉(zhuǎn)移的患者組織中，Stathmin的表達(dá)有明顯差異，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究所得到的相關(guān)結(jié)果顯示Stathmin蛋白在不同分化的結(jié)直腸癌組織中均表達(dá)上調(diào)，并且其高表達(dá)與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，與上述文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相符。

注：a圖為Stathmin蛋白在高分化結(jié)直腸癌組織中表達(dá)的免疫組織化學(xué)染色圖像，陽(yáng)性部位定位于腫瘤細(xì)胞膜或包漿；b圖為Stathmin蛋白在中分化結(jié)直腸癌組織中表達(dá)的免疫組織化學(xué)染色圖像，陽(yáng)性部位定位于腫瘤細(xì)胞膜、包漿或包核；c圖為Stathmin蛋白在低分化結(jié)直腸癌組織中表達(dá)的免疫組織化學(xué)染色圖像；d圖為Stathmin蛋白在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移灶組織中表達(dá)的免疫組織化學(xué)染色圖像；e圖為Cathepsin B蛋白在高分化結(jié)直腸癌組織中表達(dá)的免疫組織化學(xué)染色圖像；f圖為 Cathepsin B蛋白在中分化結(jié)直腸癌組織中表達(dá)的免疫組織化學(xué)染色圖像；g圖為Cathepsin B蛋白在低分化結(jié)直腸癌組織中表達(dá)的免疫組織化學(xué)染色圖像；h圖為Cathepsin B蛋白在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移灶組織中表達(dá)的免疫組織化學(xué)染色圖像

注：a圖為Stathmin蛋白在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)情況柱狀圖；b圖為Stathmin蛋白在轉(zhuǎn)移灶組織中表達(dá)情況柱狀圖；**為P<0.01,*為P<0.05

注：a圖為Cathepsin B蛋白在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)情況柱狀圖；b圖為Cathepsin B蛋白在轉(zhuǎn)移灶組織中表達(dá)情況柱狀圖；***為P<0.001)

本文免疫組化染色結(jié)果顯示低分化結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞核Stathmin蛋白陽(yáng)性表達(dá)，表明Stathmin蛋白入核與腫瘤的惡性程度的升高密切相關(guān)，但Stathmin蛋白入核的具體分子生物學(xué)機(jī)制仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。Stathmin磷酸化和去磷酸化作用在細(xì)胞周期G2-M期發(fā)揮重要作用，活性形式的Stathmin需同時(shí)具備3個(gè)或4個(gè)磷酸化位點(diǎn)的激活，從而介導(dǎo)細(xì)胞周期的順利進(jìn)行。目前較多的學(xué)者認(rèn)為，Stathmin的表達(dá)受到許多細(xì)胞因子的負(fù)性調(diào)節(jié)，如P53等。野生型的P53可以在轉(zhuǎn)錄水平抑制Stathmin蛋白的表達(dá)[19]，從而抑制細(xì)胞有絲分裂和細(xì)胞增殖活性，而突變型的P53對(duì)Stathmin的負(fù)性調(diào)控作用被解除，引起Stathmin蛋白的表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致腫瘤形成。由于P53基因的突變或缺失與大多數(shù)惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移過(guò)程密切相關(guān)，尤其與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移過(guò)程的關(guān)系更為密切[20]，本研究利用IHC對(duì)結(jié)直腸癌組織及其相應(yīng)轉(zhuǎn)移灶的腫瘤細(xì)胞中Stathmin蛋白的染色結(jié)果表明，Stathmin蛋白的表達(dá)上調(diào)可能與腫瘤細(xì)胞中突變型P53蛋白的表達(dá)上調(diào)有關(guān)。

組織蛋白酶(Cathepsin)是位于溶酶體內(nèi)的一種半胱氨酸蛋白酶超家族，其主要生物學(xué)活性是參與生物體內(nèi)某些前體蛋白的修飾。Cathepsin B是該蛋白酶超家族的重要成員之一，是由二硫鍵連接一條重鏈和一條輕鏈組成的分子量為29KD的二聚體，其重要的生物學(xué)功能之一是作為淀粉樣前體蛋白分泌酶參與淀粉樣前體蛋白的分解加工，這種淀粉樣蛋白的活性與阿爾茨海默病的發(fā)生具有密切關(guān)系[9-10]，相關(guān)研究結(jié)果表明通過(guò)調(diào)控Cathepsin B蛋白的表達(dá)可以明顯提高阿爾茨海默病患者的精神狀態(tài)與記憶能力。近期Alapati等[21]研究表明Cathepsin B與UPAR協(xié)同調(diào)節(jié)了神經(jīng)膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞的遷移活性，Cathepsin B 通過(guò)作用于JNK-MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中磷酸化的JNK以及MEKK1等蛋白的活性而促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞的遷移活性，與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。Ma等[22]通過(guò)免疫組化染色及熒光轉(zhuǎn)染等方式對(duì)食管正常黏膜組織，食管癌前病變黏膜組織及食管鱗狀細(xì)胞癌組織等的比較，揭示了Cathepsin B蛋白在正常食管黏膜組織中表達(dá)缺失，但是在食管癌前病變組織及食管鱗狀細(xì)胞癌組織中Cathepsin B蛋白的表達(dá)均上調(diào)；與對(duì)照組相比，將轉(zhuǎn)染Cathepsin B的正常食管上皮細(xì)胞接種入裸鼠體內(nèi)引起食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生，證實(shí)了Cathepsin B活性與食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本文中不同分化程度的結(jié)直腸癌組織中Cathepsin B蛋白的表達(dá)均上調(diào)，并且在轉(zhuǎn)移灶組織中的表達(dá)較高，與上述研究趨勢(shì)一致。

目前關(guān)于Cathepsin B入核的分子生物學(xué)機(jī)制了解較少，有學(xué)者認(rèn)為在腫瘤細(xì)胞發(fā)展及轉(zhuǎn)移過(guò)程中，溶酶體內(nèi)Cathepsin B的活性上調(diào)可以很好的為腫瘤細(xì)胞的前進(jìn)清理道路，使腫瘤細(xì)胞更好的運(yùn)動(dòng)并且轉(zhuǎn)移到合適的場(chǎng)所。大量研究結(jié)果均表明Cathepsin B轉(zhuǎn)染后可以上調(diào)乳腺癌細(xì)胞，胰腺癌細(xì)胞，淋巴瘤細(xì)胞等的增殖活性以及侵襲轉(zhuǎn)移能力；接種Cathepsin B陽(yáng)性表達(dá)的腫瘤細(xì)胞更容易在裸鼠體內(nèi)形成腫瘤，表明Cathepsin B在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有重要作用，可能與腫瘤的惡性程度及轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為密切相關(guān)，這與本文的研究結(jié)果相符，在低分化的結(jié)直腸癌組織中Cathepsin B蛋白在腫瘤細(xì)胞核表達(dá)上調(diào)，但是在高分化及中分化結(jié)直腸癌組織中其陽(yáng)性表達(dá)部位在腫瘤細(xì)胞膜或細(xì)胞漿。因此，Cathepsin B可能作為判斷腫瘤患者臨床分級(jí)與分期并指導(dǎo)患者預(yù)后評(píng)估的可靠蛋白。結(jié)直腸癌組織及其相應(yīng)轉(zhuǎn)移灶中Stathmin和Cathepsin B蛋白表達(dá)均上調(diào)，其表達(dá)情況與腫瘤的惡性程度關(guān)系密切，可能是監(jiān)測(cè)腫瘤臨床組織學(xué)分級(jí)的有用指標(biāo)。

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