杜娟　申磊　孫艷香

摘要：為了研究不同氨基酸不同濃度對NaCl脅迫下棉苗生理性狀和脯氨酸含量的影響，采用溫室培養(yǎng)處理，將2、4、6、8 mmol/L氨基酸與1 mol/L NaCl溶液混合后浸泡處理棉籽24 h，同設(shè)單獨(dú)鹽處理及水處理，10 d后測定棉苗生理指標(biāo)和脯氨酸含量。結(jié)果顯示，8 mmol/L瓜氨酸處理的發(fā)芽率比1 mol/L NaCl處理高很多；鳥氨酸處理的棉籽發(fā)芽勢基本都高于NaCl處理中棉籽的發(fā)芽勢，不同種類不同濃度氨基酸浸種對NaCl脅迫下棉花幼苗鮮質(zhì)量、干質(zhì)量及含水量均有不同程度的影響；所有氨基酸處理對NaCl脅迫下棉花中脯氨酸的生成均有一定的抑制作用。說明部分種類及濃度的氨基酸能緩解鹽脅迫對棉籽萌發(fā)及棉花幼苗生長的抑制作用，而對脯氨酸的生成有不同程度的抑制作用。

關(guān)鍵詞：氨基酸；棉花；生理性狀；NaCl脅迫；脯氨酸

中圖分類號(hào)： S562.01 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2014）07-0099-03

收稿日期：2014-02-19

基金項(xiàng)目：河北省教育廳項(xiàng)目（編號(hào)：Z2013014）；河北省廊坊市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃（編號(hào)：2013012003）。

作者簡介：杜娟（1983—），女，河北冀州人，碩士，助理研究員，主要從事植物保護(hù)方面的研究。E-mail：dujuan0203@163.com。

通信作者：孫艷香，博士，教授，主要從事植物轉(zhuǎn)基因遺傳方面的研究。Tel：（0316）2188092；E-mail：yx_sun70@163.com。 NaCl脅迫會(huì)造成植物發(fā)育遲緩，抑制植物組織和器官的生長和分化[1]。氨基酸能幫助植物對一些逆境作出反應(yīng)，防止葉綠體光合作用的衰減[2-3]等多種生理過程。中國鹽漬土的比例明顯高于世界平均水平，提高植物耐鹽性是克服土壤鹽漬化的一條重要途徑[4-5]。因此，研究NaCl脅迫下氨基酸與植物耐鹽性的關(guān)系具有重要意義。目前，關(guān)于氨基酸參與植物脅迫適應(yīng)的研究主要包括鹽脅迫抵抗力、調(diào)節(jié)膨壓滲透勢和陽離子膜運(yùn)輸?shù)萚6-10]；還有文獻(xiàn)報(bào)道氨基酸能夠提高植物對鹽脅迫的適應(yīng)能力，進(jìn)而提高植物的耐鹽能力[11]；近期有研究表明，NaCl處理嚴(yán)重抑制了棉苗節(jié)間伸長和葉面積的擴(kuò)展，減慢了生長速率，降低了干物質(zhì)積累，NaCl濃度越高，脅迫癥狀出現(xiàn)得越早[12]。本研究以棉花為材料，研究NaCl脅迫下不同種類不同濃度的氨基酸對棉花幼苗生理性狀的影響以及棉花幼苗中脯氨酸含量的變化，探討氨基酸緩解棉花在NaCl脅迫下的生理生化機(jī)理，以期為擴(kuò)大棉花在鹽漬地中的種植面積、進(jìn)一步提高棉花產(chǎn)量提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

供試陸地棉（Gossypium hirsutum L.）品種為農(nóng)大棉7號(hào)。

1.2研究方法

1.2.1試材培育及測定棉籽經(jīng)硫酸脫絨，清水沖洗干凈后晾干，精選外觀飽滿、大小與色澤等一致的棉籽，浸種[本試驗(yàn)中設(shè)3種氨基酸4個(gè)含量水平（分別與1 mol/L NaCl溶液混合后浸泡處理棉籽）以及水處理（水對照）、NaCl處理（鹽對照）共18個(gè)處理]至露白，選露白一致的棉籽，與草炭土 ∶珍珠巖 ∶蛭石=1 ∶1 ∶1混合于90 mm×70 mm 培養(yǎng)缽中，封上塑料膜，在光照培養(yǎng)室內(nèi)育苗，晝溫約25 ℃，夜溫約20 ℃，光強(qiáng)400 μmol/（m2·s）。每天每盆澆相同量的水，于相同條件下培養(yǎng)，其他管理措施如病蟲害防治等相同。

自發(fā)芽開始每天記錄發(fā)芽數(shù)，第7天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽勢，第10天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率。第10天洗出完整植株，快速擦干，稱得鮮質(zhì)量，并測量苗髙與根長。將棉苗放入烘箱以80 ℃烘干至恒重，然后稱得干質(zhì)量，記錄并統(tǒng)計(jì)所得數(shù)據(jù)。

1.2.2脯氨酸含量的測定

1.2.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制在分析天平上精確稱取25 mg脯氨酸，倒入小燒杯內(nèi)，用少量蒸餾水溶解，然后倒入250 mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，此標(biāo)準(zhǔn)液中含脯氨酸100 μg/mL；取6個(gè)50 mL容量瓶，分別盛入脯氨酸原液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，各瓶的脯氨酸含量分別為1、2、3、4、5、6 μg/mL。取6支試管，分別吸取2 mL系列標(biāo)準(zhǔn)含量的脯氨酸溶液及2 mL冰醋酸和 2 mL 酸性茚三酮溶液，每支試管在沸水浴中加熱30 min；冷卻后，各試管中準(zhǔn)確加入4 mL甲苯，振蕩30 s，靜置片刻，使色素全部轉(zhuǎn)至甲苯溶液；用注射器輕輕吸取各管上層脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液為空白對照，于520 nm波長處進(jìn)行比色。先求出吸光度（y）依脯氨酸含量（x）變化而變化的回歸方程，再按回歸方程式繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算2 mL待測液中脯氨酸的含量。

1.2.2.2樣品的測定（1）脯氨酸的提取。待棉花幼苗長出2～3張真葉時(shí)取葉片，并測定各處理葉片中的脯氨酸含量。準(zhǔn)確稱取不同處理的待測棉花真葉葉片各0.5 g，分別置于大管中，然后向各管中分別加入5 mL 3%磺基水楊酸溶液，在沸水浴中提取 10 min （提取過程中要經(jīng)常搖動(dòng)），冷卻后過濾于干凈的試管中，濾液即為脯氨酸的提取液。（2）吸取 2 mL 提取液于另一干凈的帶玻塞試管中，加入2 mL冰醋酸及2 mL酸性茚三酮試劑，在沸水浴中加熱30 min，溶液即呈紅色。冷卻后加入 4 mL 甲苯，搖蕩30 s，靜置片刻，取上層液至10 mL離心管中，在3 000 r/min下離心5 min。（3）用吸管輕輕吸取上層脯氨酸紅色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯為空白對照，用分光光度計(jì)在520 nm波長處比色，求得吸光度。

1.2.2.3結(jié)果計(jì)算根據(jù)回歸方程計(jì)算出（或從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出）2 mL測定液中脯氨酸質(zhì)量（x），然后計(jì)算干樣品中脯氨酸含量：脯氨酸含量（μg/g）=52x/樣品質(zhì)量（g）。

2結(jié)果與分析

2.1氨基酸浸種對NaCl脅迫下棉花幼苗生理性狀的影響

2.1.1氨基酸浸種對NaCl脅迫下棉籽發(fā)芽的影響由圖1可以看出，NaCl處理的棉籽發(fā)芽率明顯低于水處理，而不同種類、同種類不同濃度的氨基酸浸種對棉籽的發(fā)芽率也有一定的影響。用3種濃度氨基酸浸種后的棉籽發(fā)芽率均低于水處理，所有濃度精氨酸處理的棉籽發(fā)芽率均低于NaCl處理，8 mmol/L 瓜氨酸處理比NaCl處理略高一些，2、6 mmol/L鳥氨酸處理的棉籽發(fā)芽率高于NaCl處理。由此可知，在1 mol/L NaCl脅迫下，用瓜氨酸和鳥氨酸浸種對棉籽具有一定的緩解作用，而精氨酸對棉籽的緩解作用較小。

由圖2可以看出，NaCl處理棉籽的發(fā)芽勢明顯低于水處理，而精氨酸處理的棉籽發(fā)芽勢均比NaCl處理低，鳥氨酸處理的棉籽發(fā)芽勢基本都高于NaCl處理，瓜氨酸處理的棉籽發(fā)芽勢只有在濃度為8 mmol/L時(shí)才高于NaCl處理。由此可知，用不同種類、不同濃度的氨基酸浸種對NaCl脅迫下的棉籽發(fā)芽勢影響不同，經(jīng)鳥氨酸浸種處理后的棉籽發(fā)芽勢較高，而經(jīng)精氨酸浸種的棉籽發(fā)芽勢較NaCl處理低，說明精氨酸緩解鹽脅迫的作用并不明顯。

2.1.2氨基酸浸種對鹽脅迫下棉花幼苗生長的影響由表1可知，精氨酸處理組中，水對照，2、4 mmol/L精氨酸處理的棉花苗高與NaCl處理差異顯著，6、8 mmol/L精氨酸與NaCl處理差異不顯著；瓜氨酸處理組中，水處理與6 mmol/L瓜氨酸處理苗高差異顯著，與其他濃度處理差異不顯著；鳥氨酸處理中除濃度為4 mmol/L的棉花外，其他處理的棉花苗均比NaCl處理高，與水處理和NaCl處理苗高差異不顯著。

從表1還可以看出，精氨酸處理的棉花根長均比NaCl處理的短，均與水處理差異顯著，只有4、6 mmol/L精氨酸處理的棉花根長與NaCl處理差異顯著。瓜氨酸處理的根長均與水處理差異顯著；只有6 mmol/L瓜氨酸處理的根長比NaCl處理短且差異顯著，其他處理的根長均大于NaCl處理但差異不顯著。鳥氨酸處理中只有濃度為2 mmol/L處理的棉花根長大于NaCl處理，與水處理和NaCl處理差異均不顯著；其他處理均與水處理和NaCl處理差異顯著。

3結(jié)論與討論

一般認(rèn)為，棉花耐鹽能力在萌發(fā)出苗階段最弱，隨著生育進(jìn)程的進(jìn)行不斷增強(qiáng)。在沿海灘涂地區(qū)，成苗難是棉花生產(chǎn)上尚未解決而亟待解決的問題。由于棉花幼苗對鹽分比較敏感，因此根系發(fā)育的好壞影響根系對水分和養(yǎng)分的吸收，對棉苗的耐鹽性尤其重要[13-14]。有研究認(rèn)為，鹽脅迫可以增加根系分泌物中氨基酸的種類和含量。隨著鹽脅迫濃度的增大和黃瓜生長時(shí)間的延長，各處理用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）檢出的化合物種類和總含量呈減少的趨勢[15]。

本研究結(jié)果表明，在相同濃度NaCl脅迫下，有幾個(gè)濃度的氨基酸浸種處理后使棉花幼苗根長略大于NaCl處理，但其他幾個(gè)濃度處理的根長甚至有遠(yuǎn)小于NaCl處理棉花根長的現(xiàn)象。由此推測，棉花根部存在一個(gè)耐NaCl閾值，當(dāng)土壤中NaCl濃度在閾值范圍內(nèi)時(shí)，棉花根長與土壤NaCl濃度呈正比關(guān)系；當(dāng)超出閾值時(shí)，棉花根部會(huì)因受NaCl脅迫而受到影響，從而根長減小，而不同種類、不同濃度的氨基酸處理可以不同程度提高耐鹽閾值。這個(gè)推測是否成立，尚待論證。

同時(shí)，在對本研究中所得各組棉花葉片的脯氨酸含量進(jìn)行分析以及與預(yù)期結(jié)果進(jìn)行對比后發(fā)現(xiàn)，氨基酸浸種并未很大程度地提升NaCl脅迫下棉花幼苗中的脯氨酸含量，甚至經(jīng)氨基酸浸種后棉花葉片中脯氨酸含量少于NaCl處理。有大量研究表明，脯氨酸的大量積累是高等植物受NaCl脅迫等滲透脅迫時(shí)的正常生理生化現(xiàn)象，因?yàn)樵跐B透脅迫下，脯氨酸既作為滲透調(diào)節(jié)劑維持低水勢，又保護(hù)生物大分子不受NaCl離子的毒害[16]。本研究中脯氨酸在經(jīng)氨基酸浸種后的生成會(huì)受到抑制，是因?yàn)楦彼岬纳芍饕?個(gè)途徑：谷氨酸途徑和鳥氨酸途徑，而鳥氨酸又可與精氨酸、瓜氨酸形成一個(gè)循環(huán)途徑[17]。由此可知，當(dāng)棉花受到鹽脅迫時(shí)，其體內(nèi)會(huì)生成大量脯氨酸以保證自己的正常生長發(fā)育，然而當(dāng)對其以精氨酸、鳥氨酸或瓜氨酸進(jìn)行處理后，合成脯氨酸的重要途徑——鳥氨酸途徑會(huì)受到抑制，從而使脯氨酸的合成受到抑制，最終使其脯氨酸含量小于NaCl脅迫下未經(jīng)氨基酸處理的棉花。

本試驗(yàn)從棉籽萌發(fā)、棉花幼苗生長及棉花葉片中脯氨酸的含量幾個(gè)方面比較了經(jīng)氨基酸浸種與未經(jīng)氨基酸浸種的棉花受NaCl脅迫時(shí)的差異，從而發(fā)現(xiàn)不同濃度的瓜氨酸、鳥氨酸、精氨酸對緩解棉花NaCl脅迫的作用不同。總的來說，部分種類、部分濃度的氨基酸能緩解NaCl脅迫對棉籽萌發(fā)及棉花幼苗生長的抑制作用，精氨酸、瓜氨酸、鳥氨酸浸種對棉花植株中脯氨酸的生成有不同程度的抑制作用。

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