申慧芳+申惠敏+賈秀珍等

摘要：用昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)表達了高致病性禽流感H5N1 HA蛋白，經SDS-PAGE和Western blot檢測，HA蛋白表達分子量約為70 ku；將HA蛋白制成油乳液，免疫BALB/c小鼠，免疫3次后，收集血清，以血凝抑制試驗（HI）和血清IgG抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）評估體液免疫，酶聯(lián)免疫斑點試驗（ELISPOT）評估細胞免疫。試驗結果表明：重組HA蛋白組和全病毒滅活疫苗組免疫小鼠后，血清中和抗體效價及ELISA IgG效價均顯著高于PBS 組，重組HA蛋白組和全病毒滅活疫苗組之間差異不顯著。ELISPOT試驗數(shù)據顯示，重組HA蛋白組和全病毒滅活疫苗組小鼠脾單個核細胞分泌IFN-γ和IL-4細胞數(shù)量顯著高于PBS組，而重組HA蛋白組和全病毒滅活疫苗組之間差異不顯著。用昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)表達H5N1 HA蛋白制成油乳液能誘導體液免疫和細胞免疫，能為預防高致病性禽流感H5N1候選疫苗的篩選提供依據。

關鍵詞：H5N1高致病性禽流感；Sf9昆蟲細胞；HA蛋白；免疫反應

中圖分類號： S855.3 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）07-0024-04

收稿日期：2014-03-14

基金項目：國家自然科學基金（編號：31360212）；廣東省深圳市科技研發(fā)資金基礎研究計劃（編號：JC201105201028A）。

作者簡介：申慧芳（1976—），女，山西長治人，博士，副教授，主要從事食品安全生物學研究。E-mail：hethershen@gmail.com。禽流感（avian influenza）是由禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）引起的一種禽類傳染病，其中高致病性禽流感（high pathogenic avian influenza，HPAI）H5N1亞型更是養(yǎng)禽業(yè)的一大災難性疾病，不僅給養(yǎng)禽業(yè)帶來了巨大的經濟損失；同時，它正在突破種間屏障，引起人類感染，從病禽直接感染人類病死率高達60%[1]，給公共衛(wèi)生帶來威脅。可通過減少禽對禽的傳播以及禽對人類的傳播，并進行有效的免疫來保護養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展[2]。預防H5N1高致病性禽流感的傳統(tǒng)疫苗是由雞胚生產的。然而這種方法生產疫苗存在很大的風險，如由于病毒致死雞胚而影響疫苗生產[3]。另外，高致病性禽流感的疫苗生產和處理需要生物安全三級實驗室[4]。因此，尋找一種可以替代傳統(tǒng)疫苗而又高效安全的疫苗就成了當務之急。

血凝素蛋白（hemagglutinin，HA）是禽流感病毒最重要的結構蛋白，在病毒吸附、穿膜及決定病毒的宿主特異性和致病力方面均起著關鍵的作用[5]。HA蛋白也是AIV誘導保護性免疫的主要抗原，它刺激機體所產生的抗體可以中和病毒、抵抗感染[6-7]。因此，HA蛋白成為發(fā)展亞單位疫苗的首選[8]。當流感疫情發(fā)生時，只要分離到流行毒株，進行HA基因測序就可以進行序列合成并表達蛋白，這種方式周期短、產量高，將在流感疫情高發(fā)時代替?zhèn)鹘y(tǒng)疫苗進行快速有效地控制病癥的流行。

本試驗選用Bac-to-Bac昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)進行重組HA蛋白表達，用表達的HA蛋白和H5N1禽流感全病毒滅活疫苗進行體液免疫和細胞免疫評估，為今后研制快速、高效、安全的H5N1禽流感疫苗提供有效的依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1菌株與質粒E. coli DH5α菌種（筆者所在實驗室保存）；E.coli DH10Bac菌種、pFastbacDual質粒、Sf9昆蟲細胞、Cellfectin Ⅱ Reagent購自Invitrogen公司；pMD-18 T載體、Taq DNA 聚合酶、T4 DNA 連接酶、限制性內切酶均購自TaKaRa公司；sf 900 Ⅱ SFM、Graces Insect Cell Culture Medium 購自 GIBCO公司；質粒提取試劑盒購自天根生物工程公司；DNA 膠回收試劑盒、預染蛋白質 Marker 購自Fermentas公司；顯影液定影液購自碧云天生物技術研究所；ECL顯色液、DAB顯色液均購自BBI公司；H5N1高致病性禽流感高免血清購自廣東溫氏研究院；HRP標記的兔抗雞IgG購自KPL公司；其他試劑均為國產分析純。

1.1.2試驗動物6周齡BALB/c小鼠（體質量16～18 g/只）購自中山大學實驗動物中心。

1.1.3陽性對照疫苗本研究免疫組用的陽性對照為肇慶大華農生物藥品有限公司生產的重組禽流感病毒滅活疫苗 H5N1亞型，Re-5，獸藥生字（2006）190022098；證書編號：（2007）獸藥GMP 證字178號。

1.2試驗方法

1.2.1HA 基因的獲得參照GenBank中注冊的禽流感病毒A/goose/GD/96（H5N1）毒株（序列號HA：NC_007362.1），將HA基因送去Invitrogen公司進行核苷酸序列合成。根據合成的序列設計用以擴增HA基因的特異性引物，其中上游引物H5N1-HA-F：5′-CGCGGATCCGATGGAGAAAATAGTGC-3′（含BamHⅠ酶切位點）；下游引物H5N1-HA-R：5′-CCGGTCGACTTAAATGCAAATTCTG-3′（含SalⅠ酶切位點）。 PCR擴增體系為50 μL，其中5×PCR buffer 10 μL，dNTP（各2.5 mmol/L）4 μL，模板1 μL，引物各1 μL，Taq酶 0.5 μL，滅菌雙蒸水補至50 μL。純化的PCR產物經 BamHⅠ 和SalⅠ雙酶切，連接至經相同限制性內切酶酶切的質粒pFastbacDual，轉化DH5α感受態(tài)細胞。酶切鑒定后，篩選出重組質粒 pFastbacDual-HA。將陽性重組質粒 pFastbacDual-HA 轉化DH10Bac感受態(tài)細胞，通過藍白斑篩選和PCR鑒定后，抽提重組桿粒rBacmid-HA，PCR鑒定時使用的通用序列參照Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)使用手冊。所有引物均由上海生物工程有限公司合成。

1.2.2重組蛋白HA的表達重組的rBacmid-HA通過CellfectinⅡreagent轉染進昆蟲細胞Sf9。將Sf9細胞置于含有10% FBS（胎牛血清）的Grace昆蟲細胞培養(yǎng)基，28 ℃孵育。當6孔板中每孔細胞濃度為1×106個/mL時，讓其吸附 1 h。將 1 μg rBacmid-HA（Bacmid空桿粒作為陰性對照）溶于 100 μL 不完全培養(yǎng)基中（不含血清或雙抗的Grace培養(yǎng)基）；將5 μL Cellfectin溶于100 μL不完全培養(yǎng)基；兩者混合均勻在室溫孵育 15～45 min后加入Sf9細胞，28 ℃孵育 5 h，棄去轉染培養(yǎng)基，加入新鮮培養(yǎng)基。當細胞出現(xiàn)明顯病變后（第 1 代約需4 d），收集含病毒的培養(yǎng)上清，即為第一代重組病毒，記為P1。P1代病毒種子液量少、效價低，用 P1繼續(xù)感染Sf9細胞產生效價高的P2種子液。P2代病毒液感染細胞后，收集感染72 h 后的細胞培養(yǎng)上清直接用于后續(xù)檢測。細胞用PBS（磷酸鹽緩沖液）洗3次，經3次反復凍融后超聲破碎，然后在4 ℃、12 000 g 條件下離心 10 min，取上清，用12% SDS-PAGE（十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺）膠進行蛋白電泳檢測。

1.2.3表達產物的鑒定將 SDS-PAGE電泳中得到的蛋白用半干法轉至PVDF（聚偏二氟乙烯）膜上，含3%BSA（牛血清白蛋白）封閉；1 ∶1 000的H5N1禽流感高免血清作為一抗，1 ∶5 000的HRP標記的兔抗雞IgG作為二抗，用ECL進行顯色。

1.2.4間接免疫熒光試驗（IFA）通過間接免疫熒光試驗觀察重組蛋白在Sf9細胞的表達及定位。在6孔板中以 1×106個/mL 的濃度接種Sf9細胞，貼壁2 h后，接種約0.5個MOI（病毒感染復數(shù)）的重組桿狀病毒上清。感染48 h后，用PBS 清洗細胞3 次；用4%多聚甲醛固定細胞15 min，PBS 洗細胞3 次；用預冷的100%甲醇（4 ℃）處理10 min，PBS清洗3次；3% BSA室溫封閉1 h，PBS 清洗3 次；以H5亞型免疫陽性血清為一抗（1 ∶200），37 ℃ 孵育1 h，PBS清洗細胞3 次；用1 ∶1 000倍稀釋的FITC（異硫氰酸熒光素）標記的熒光二抗，37 ℃避光孵育1 h，PBS 清洗細胞3 次；置于熒光顯微鏡下拍照。

1.2.5油乳液疫苗的制備將定量后的細胞破碎液與油乳劑按2 ∶1體積混合，高速勻漿，獲得的油乳劑疫苗4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6動物分組與免疫試驗選取體質量16～18 g的6周齡BALB/c 雌性小鼠隨機分成3組，分別為重組HA蛋白組、H5N1禽流感滅活疫苗組和PBS組（陰性對照），每組10只。采用頸部皮下多點注射，從6周齡開始進行免疫，此后每間隔14 d加強免疫1次，共免疫3次，每次免疫劑量為10 μg/只，以HA蛋白含量為標準。3次免疫后，每組隨機取5只試驗小鼠，眼球取血，室溫下分離血清，用HI和ELISA方法檢測H5N1抗體水平。每個試驗組隨機取3只小鼠，取脾臟，用淋巴細胞分離液分離脾淋巴細胞，進行酶聯(lián)免疫斑點試驗（ELISPOT），檢測分泌IFN-γ與IL-4細胞因子的細胞數(shù)量。

1.2.7血凝抑制試驗（HI試驗）參照《國家流感中心標準操作規(guī)程》中的“流感/禽流感病毒血凝抑制試驗（HI）操作細則”進行操作。

1.2.8間接酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測IgG抗體采用棋盤法確定最佳的抗原包被濃度、血清稀釋度。用 100 μL/孔包被96孔板，用1%BSA封閉，加入用0.1% BSA稀釋的待檢血清于上述已包被的反應孔中，充分洗滌后，加入 1 ∶10 000 的HRP標記的羊抗鼠IgG抗體，在酶標儀上讀取450 nm下的吸光度（D450 nm）。

1.2.9酶聯(lián)免疫吸附斑點試驗按達科為生物公司“酶聯(lián)免疫吸附斑點試驗操作細則”進行操作，將ELISPOT板斑點計數(shù)，并將重組HA蛋白組、全病毒滅活疫苗組及PBS組分別作數(shù)據間的t檢驗，進行統(tǒng)計學分析。

2結果與分析

2.1HA基因的克隆

以合成的A/duck/Guangdong/22/2002（H5N1）禽流感HA基因為模板，進行PCR擴增，將HA的PCR產物和 pFastBacDual 經BamHⅠ和SalⅠ雙酶切后，回收并連接，連接產物轉化DH5α感受態(tài)細胞，經瓊脂糖凝膠電泳檢測及測序，獲得擴增產物大小為1 707 bp，與預計擴增片段長度相符合（圖1），表明已篩選出重組質粒pFastBacDual-HA。

2.2重組桿粒構建

將重組質粒pFastBacDual-HA轉化到DH10Bac中，通過慶大霉素、卡那霉素、四環(huán)素3種抗性和Blue-Gal藍白斑篩選得到陽性單菌落克隆，提取桿粒rBacmid-HA，用特異性引物M13通過PCR鑒定重組桿狀病毒，與預期結果一致（圖2）。

2.3Western blot鑒定重組HA蛋白的表達

將rBacmid-HA病毒種子液以1倍感染復數(shù)（MOI=1）接種Sf9昆蟲細胞，收集72 h后的細胞培養(yǎng)上清，超聲破碎，進行Western blot分析，一抗為H5N1亞型禽流感高免血清，二抗為HRP標記的兔抗雞IgG，以野生桿狀病毒表達蛋白作為對照。如圖3所示，出現(xiàn)分子量約70 ku的單一多肽，證明重組桿狀病毒表達了HA蛋白。在昆蟲細胞中，重組HA蛋白沒有裂解為HA1和HA2亞基。

2.4間接免疫熒光結果

重組桿狀病毒感染Sf9細胞48 h后進行IFA，從而鑒定及定位重組HA蛋白的表達，結果顯示，重組蛋白高效表達于細胞表面（圖4）。

2.5體液免疫

2.5.1免疫BALB/c小鼠血清中HI效價用重組的HA蛋白油乳液、全病毒滅活疫苗和PBS免疫BALB/c小鼠，檢測3免后小鼠血清中HI效價。結果顯示，免疫重組HA蛋白組和全病毒滅活疫苗組顯著高于PBS對照組，而重組HA蛋白組和全病毒滅活疫苗組差異不顯著（圖5-A）。

2.5.2免疫BALB/c小鼠血清中IgG抗體水平檢測用間接ELISA檢測BALB/c小鼠血清中IgG抗體，結果顯示，重組HA蛋白組與全病毒滅活疫苗組IgG抗體均有升高，兩者顯著高于PBS組（P<0.05），重組HA蛋白組與全病毒滅活疫苗組差異不顯著（圖5-B）。

2.6免疫小鼠脾淋巴細胞中分泌細胞因子IFN-γ和IL-4檢測

用大腸桿菌BL21表達的HA蛋白作抗原，刺激3次免疫后小鼠脾淋巴細胞，通過ELISPOT技術對產生的細胞因子IFN-γ和IL-4進行檢測。結果顯示，重組HA蛋白組和全病毒滅活疫苗組脾淋巴細胞經刺激后分泌細胞因子IFN-γ和IL-4的細胞數(shù)量均顯著高于PBS組（P<0.05），但重組HA蛋白組和全病毒滅活疫苗組之間差異不顯著（圖6）。

3結論與討論

H5N1型高致病性禽流感病毒在世界范圍內分布廣、危害性大，不僅造成了養(yǎng)禽業(yè)的巨大損失，也影響到人類健康和安全。目前，尚無特效藥物用于臨床治療，接種疫苗是預防和控制該病發(fā)生的主要手段和途徑。傳統(tǒng)疫苗用雞胚生產，生產周期長、生物安全性要求高，無法應對流感病毒的大范圍流行。本研究用昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)生產的重組HA蛋白，表達效率高、周期短、生物安全性好。 HI試驗結果顯示：重組HA蛋白與全病毒滅活苗免疫產生的效價相一致，HI效價的高低與攻毒免疫保護有直接的相關[9-15]，HI效價越高對禽流感病毒感染的保護效果越好，保護的時間越長；ELISA結果表明：重組HA蛋白的IgG抗體與全病毒滅活疫苗之間無顯著差別；ELISPOT試驗結果表明：重組HA蛋白組可誘導產生強烈的細胞免疫應答，有利于機體對感染病毒和細胞的直接殺傷，從而快速清除機體內的病毒。

本試驗從通過獲得H5N1 HA基因序列到轉染昆蟲細胞，進行HA蛋白高效表達（分子量約70 ku），以及感染細胞裂解，制備油乳液，全部過程只用了約30 d；通過BALB/c小鼠免疫，刺激機體產生較強的體液免疫和細胞免疫反應，為禽流感基因工程亞單位疫苗的研發(fā)奠定了基礎。

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