蔣海麗，張彥婷，石 科，韓 康，王瑞莉，龔方華，王 靜，1，#，關(guān)方霞#

1)鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 鄭州450001 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院細(xì)胞生物學(xué)研究室 鄭州450052

蛋白酶體激活因子PA28α對(duì)Eca109和EC9706細(xì)胞細(xì)胞周期和凋亡的影響*

1)鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 鄭州450001 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院細(xì)胞生物學(xué)研究室 鄭州450052

#通訊作者：薛樂(lè)勛，男，1944年2月生，教授，研究方向：腫瘤標(biāo)志物與基因工程，E-mail: xuelx@zzu.edu.cn；關(guān)方霞，女，1969年2月生，博士，教授，研究方向：干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)，E-mail: guanfangxia@126.com

PA28α；食管鱗癌細(xì)胞；細(xì)胞周期；細(xì)胞凋亡

目的：探討蛋白酶體激活因子PA28α對(duì)食管鱗癌細(xì)胞周期和凋亡的影響。方法擴(kuò)增PA28α的cDNA全長(zhǎng)序列并連接到pCMV-Myc上，構(gòu)建真核表達(dá)載體pCMV-Myc-PA28α，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染食管鱗癌細(xì)胞系Eca109和EC9706，熒光顯微鏡觀察PA28α蛋白在細(xì)胞中的定位；Western blot法鑒定重組載體的表達(dá)；流式細(xì)胞儀檢測(cè)PA28α在食管鱗癌EC9706細(xì)胞中過(guò)表達(dá)對(duì)其細(xì)胞周期和凋亡的影響。結(jié)果轉(zhuǎn)染了重組載體pCMV-Myc-PA28α的食管鱗癌Eca109和EC9706細(xì)胞中PA28α蛋白主要存在于細(xì)胞質(zhì)。與空載體轉(zhuǎn)染組(0.342±0.007)相比，pCMV-Myc-PA28α轉(zhuǎn)染組(1.073±0.040)EC9706細(xì)胞中有較高的PA28α蛋白表達(dá)(F=984.411，P<0.001)。與空載體轉(zhuǎn)染組(37.642±1.000)相比，pCMV-Myc-PA28α轉(zhuǎn)染組(39.258±0.154)EC9706細(xì)胞處于S期細(xì)胞比例明顯增高(F=24.592，P<0.001)。pCMV-Myc-PA28α轉(zhuǎn)染組EC9706細(xì)胞的凋亡率(14.463%±0.634%)明顯低于空載體轉(zhuǎn)染組(43.893%±0.473%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1 448.569，P<0.001)。結(jié)論P(yáng)A28α與食管鱗癌的凋亡有密切關(guān)系，可能成為治療食管鱗癌的一個(gè)有效靶點(diǎn)。

在真核細(xì)胞中，蛋白酶體系統(tǒng)是生物體內(nèi)重要的蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)，受多種復(fù)雜因素的調(diào)控，通過(guò)有目的地降解受損傷的或者錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)進(jìn)而調(diào)節(jié)整個(gè)細(xì)胞的生命過(guò)程。有資料[1]表明，蛋白酶體是真核細(xì)胞中一種主要的非溶酶體蛋白降解系統(tǒng)，細(xì)胞內(nèi)70%或80%以上的蛋白質(zhì)由蛋白酶體降解。最普遍的蛋白酶體形式為26S蛋白酶體，由20S核心顆粒與具有激活核心顆粒作用的蛋白酶體激活因子組成[2]。在蛋白酶體激活因子作用下，蛋白質(zhì)底物進(jìn)入20S核心顆粒的中心水解部位而被降解。

目前，在生物體內(nèi)主要發(fā)現(xiàn)了兩大類(lèi)重要的蛋白酶體激活因子，一類(lèi)是19S蛋白酶體激活因子，又稱(chēng)PA700，主要參與機(jī)體內(nèi)依賴(lài)ATP及泛素的蛋白質(zhì)的降解；另一類(lèi)是PA28蛋白酶體激活因子家族，又稱(chēng)11S或REG，主要參與調(diào)控機(jī)體內(nèi)非ATP及非泛素依賴(lài)的蛋白質(zhì)降解作用[3]。近年來(lái)已陸續(xù)發(fā)現(xiàn)不少蛋白質(zhì)，如一些氧化性蛋白、受損傷的及錯(cuò)誤折疊的蛋白等，以非泛素依賴(lài)的方式被蛋白酶體降解，即由11S和20S組成的蛋白酶體降解，11S包括包括PA28α、PA28β和PA28γ 3個(gè)成員[4]。 研究[4]顯示PA28α基因編碼的蛋白在很多惡性腫瘤組織中的表達(dá)都存在異常。作者研究了該基因在食管鱗癌細(xì)胞中的重組表達(dá)以及重組表達(dá)后對(duì)細(xì)胞周期和凋亡的影響，為進(jìn)一步深入研究PA28α在食管鱗癌中的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料食管鱗癌細(xì)胞系(Eca109、EC9706)和pCMV-Myc載體均由鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院保存。PCR、qRT-PCR引物(北京六合華大基因科技股份有限公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Premix Ex Taq(大連寶生物工程有限公司)，RPMI 1640 細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶(美國(guó)Hyclone公司)，PA28α多克隆抗體(百奇生物科技有限公司)，β-actin多克隆抗體(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)，LipofectamineTM2000(美國(guó)Invitrogen公司)，Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(美國(guó)SAB公司)，細(xì)胞全蛋白提取試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]。

1.2重組載體的構(gòu)建與鑒定Trizol法提取食管鱗癌細(xì)胞總的RNA，經(jīng)純度、濃度以及完整性鑒定合格后，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物：PA28α上游引物5’-CGGAATTCGGATGGCCATGCTCAGG-3’，下游引物5’-ATAGTTTAGCGGCCGCTCAATAGATCATTCC-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物大小750 bp。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共循環(huán)30次；72 ℃ 10 min，4 ℃終止反應(yīng)。10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，分析目的基因擴(kuò)增結(jié)果，并送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。目的片段PA28α與pMD18-T載體連接，經(jīng)EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切，驗(yàn)證目的片段的正確性，回收目的片段?？蛰d體pCMV-Myc和目的片段PA28α同時(shí)經(jīng)EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切，將酶切后目的片段和載體片段以物質(zhì)的量的比為3:1連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌后，挑選單個(gè)菌落擴(kuò)大培養(yǎng)并提取質(zhì)粒。EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切鑒定質(zhì)粒，并送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)及重組載體的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Eca109、EC9706細(xì)胞生長(zhǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞達(dá)到70%～80%融合時(shí)，采用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法分別轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pCMV-Myc(空載體轉(zhuǎn)染組)和重組質(zhì)粒pCMV-Myc-PA28α(pCMV-Myc-PA28α轉(zhuǎn)染組)，以未處理的細(xì)胞作為空白對(duì)照組。具體操作按照LipofectamineTM2000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4pCMV-Myc-PA28α重組蛋白定位的細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)重組質(zhì)粒pCMV-Myc-PA28α轉(zhuǎn)染Eca109、EC9706細(xì)胞48 h后，用PA28α多克隆抗體及相對(duì)應(yīng)的二抗做細(xì)胞免疫熒光染色，用顯微熒光攝像/照相系統(tǒng)分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染了pCMV-Myc和pCMV-Myc-PA28α的食管鱗癌細(xì)胞株中PA28α蛋白的表達(dá)情況。

1.5pCMV-Myc-PA28α重組蛋白表達(dá)的Westernblot檢測(cè)用全蛋白提取試劑盒提取空白對(duì)照組、空載體轉(zhuǎn)染組和pCMV-Myc-PA28α轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的總蛋白，用改良Bradford法測(cè)定蛋白濃度，取出40 μL蛋白加入Loading Buffer，沸水中煮10 min，使蛋白完全變性。SDS-聚丙烯酰胺凝電泳分離蛋白，每孔上樣量50 μg，濃縮膠電壓80 V(30 min)，分離膠電壓120 V(1 h)。切下所需大小條帶，制作濾紙-PVDF-濾紙“三明治”結(jié)構(gòu)，經(jīng)半干式電轉(zhuǎn)儀22 V轉(zhuǎn)膜18 min。100 g/L的脫脂牛奶室溫封閉1 h，PA28α多克隆抗體(按1:200稀釋)4 ℃過(guò)夜孵育及相應(yīng)二抗(按1:3 000稀釋) 37 ℃孵育1 h，以β-actin作為內(nèi)參蛋白，ECL發(fā)光液A液和B液等體積混合液處理后暗室內(nèi)曝光膠片，膠片經(jīng)掃描儀掃描。每組均設(shè)3個(gè)平行對(duì)照。

1.6重組蛋白過(guò)表達(dá)后細(xì)胞周期的檢測(cè)收集轉(zhuǎn)染后48 h的EC9706細(xì)胞，冰冷PBS洗2遍，體積分?jǐn)?shù)70%的冰乙醇固定，4 ℃過(guò)夜。800 r/min離心，棄乙醇，PBS洗2遍。PBS重懸細(xì)胞，加入RNAase(終質(zhì)量濃度50 mg/L)室溫放置1 h。調(diào)整細(xì)胞密度為1×106mL-1，加1 mL PI(終質(zhì)量濃度100 mg/L)避光30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。每組均設(shè)3個(gè)平行對(duì)照。

1.7重組蛋白過(guò)表達(dá)后細(xì)胞凋亡的檢測(cè)用無(wú)EDTA、胰蛋白酶的消化液消化、收集轉(zhuǎn)染后48 h的EC9706細(xì)胞，0.5 mL PBS重懸細(xì)胞，用未處理的、只加Annexin V-FITC、只加PI、加Annexin V-FITC和PI分別作為未染色管、單染Annexin V-FITC管、單染PI管、雙染管，以未染色管細(xì)胞調(diào)零機(jī)器，以單染Annexin V-FITC管和單染PI管作為基準(zhǔn)參考，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況。每組均設(shè)3個(gè)平行對(duì)照。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0進(jìn)行分析，應(yīng)用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)比較3組間PA28α的表達(dá)水平、PA28α過(guò)表達(dá)后細(xì)胞周期的變化以及PA28α過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定如圖1A所示，所提RNA的28S和18S條帶清晰，沒(méi)有彌散現(xiàn)象，說(shuō)明所提總RNA質(zhì)量較高，達(dá)到了反轉(zhuǎn)錄為cDNA的要求。退火溫度梯度PCR結(jié)果(圖1B)顯示，擴(kuò)增出的DNA特異條帶大小約為750 bp，測(cè)序結(jié)果表明，目的片段為PA28α，其序列的大小、方向和讀碼框都正確。將目的基因PA28α與pMD18-T連接，經(jīng)EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切后，回收目的片段與pCMV-Myc連接， 雙酶切及測(cè)序分析結(jié)果顯示重組質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖1C、圖1D)。

圖1 細(xì)胞總RNA 完整性鑒定、PA28α的溫度梯度擴(kuò)增及酶切鑒定

A：從左至右依次為Het-1A、Eca109和EC9706 3種細(xì)胞總RNA提取結(jié)果；B：PA28α的溫度梯度擴(kuò)增；C：PA28α與pMD18-T連接雙酶切鑒定；D：PA28α與pCMV-Myc連接雙酶切鑒定；M：Marker；1、2、3、4、5：分別代表退火溫度為50、52、54、56、58 ℃時(shí)PA28α基因擴(kuò)增產(chǎn)物；6、8：分別為pMD18-T-PA28α、pCMV-Myc-PA28α；7、9：PA28α。

2.2pCMV-Myc-PA28α重組蛋白在食管鱗癌細(xì)胞中的定位見(jiàn)圖2。由圖2可知，PA28α主要分布在細(xì)胞質(zhì)，轉(zhuǎn)染pCMV-Myc-PA28α載體的Eca109和EC9706細(xì)胞的熒光均強(qiáng)于未轉(zhuǎn)染pCMV-Myc空載體細(xì)胞，證明重組載體pCMV-Myc-PA28α已成功在2株食管鱗癌細(xì)胞株中表達(dá)。

A、C：pCMV-Myc空載體分別轉(zhuǎn)染Eca109、EC9706細(xì)胞；B、D：pCMV-Myc-PA28α載體分別轉(zhuǎn)染Eca109、EC9706細(xì)胞。圖中藍(lán)色為細(xì)胞核，紅色為PA28α蛋白。

2.3EC9706細(xì)胞中pCMV-Myc-PA28α重組蛋白的表達(dá)見(jiàn)圖3。結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組(0.271±0.012)和空載體轉(zhuǎn)染組(0.342±0.007)相比，pCMV-Myc-PA28α轉(zhuǎn)染組(1.073±0.040)有較高的PA28α蛋白表達(dá)水平(F=984.411，P<0.001)。

圖3 EC9706細(xì)胞轉(zhuǎn)染后PA28α的表達(dá)

1、2、3：分別為EC9706細(xì)胞的空白對(duì)照組、空載體轉(zhuǎn)染組、pCMV-Myc-PA28α轉(zhuǎn)染組。

2.4PA28α過(guò)表達(dá)對(duì)食管鱗癌EC9706細(xì)胞周期及凋亡的影響見(jiàn)表1、2。

表1 PA28α過(guò)表達(dá)對(duì)食管鱗癌細(xì)胞EC9706周期的影響 %

*:與空白對(duì)照組相比，P<0.05。

表2 PA28α過(guò)表達(dá)對(duì)食管鱗癌細(xì)胞EC9706凋亡的影響 %

*:與空白對(duì)照組相比，P<0.05；#：與空載體轉(zhuǎn)染組相比，P<0.05。

3 討論

蛋白酶體是多亞基蛋白酶，負(fù)責(zé)選擇性降解真核生物體內(nèi)受損傷的或者錯(cuò)誤折疊的功能蛋白分子，能夠?qū)⒌鞍踪|(zhì)降解為含7～9個(gè)氨基酸肽段。蛋白酶體可以作為治療腫瘤的藥物靶點(diǎn)，其中比較成功的例子是蛋白酶體抑制劑硼替佐米在臨床上被用來(lái)治療多發(fā)性骨髓瘤，并取得了很好的治療效果，但易產(chǎn)生耐藥性，且對(duì)實(shí)體瘤的臨床實(shí)驗(yàn)效果差。

目前研究發(fā)現(xiàn)多種人類(lèi)惡性腫瘤中存在PA28異常表達(dá)現(xiàn)象。張林等[5]發(fā)現(xiàn)PA28α基因可以抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖，同時(shí)還影響胃癌細(xì)胞的細(xì)胞周期，對(duì)抑制胃癌細(xì)胞的惡性表現(xiàn)有一定的意義。Longuespée等[6]采用蛋白質(zhì)組學(xué)方法檢測(cè)到PA28α在正常卵巢上皮中定位和在癌細(xì)胞中定位不同，分別定位在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)，因此PA28α可以作為卵巢癌的潛在生物學(xué)標(biāo)記。有研究[7]表明在前列腺癌中PA28有顯著的上調(diào)現(xiàn)象，并且增強(qiáng)了癌細(xì)胞的遷移能力，被作為檢測(cè)前列腺癌的一個(gè)潛在的生理指標(biāo)。

值得注意的是，經(jīng)γ-干擾素誘導(dǎo)，PA28α在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)顯著上調(diào)，能夠參與免疫反應(yīng)，是免疫蛋白酶體的組成部分；它編碼的蛋白與蛋白酶體在機(jī)體免疫系統(tǒng)中亦起重要作用，能夠輔助MHC-Ⅰ類(lèi)分子將胞內(nèi)的抗原肽呈遞到細(xì)胞表面被CD8+分子識(shí)別，進(jìn)行免疫反應(yīng)，可影響與MHC-Ⅰ類(lèi)分子結(jié)合的病毒或腫瘤抗原的加工，并與細(xì)胞表面細(xì)胞毒性T細(xì)胞識(shí)別的抗原表位的形成和維持有關(guān)[8]。γ-干擾素誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)抗原呈遞的機(jī)制不是通過(guò)誘導(dǎo)免疫蛋白酶體的亞基而是通過(guò)誘導(dǎo)蛋白酶體激活因子PA28α的合成，合成的PA28α和20S綁定，進(jìn)一步參與免疫反應(yīng)。因此，PA28α基因與惡性腫瘤的相關(guān)性可能涉及調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)蛋白的降解和細(xì)胞免疫功能兩個(gè)方面，其確切機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

我國(guó)是食管鱗癌的高發(fā)區(qū)，因此，了解食管鱗癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制成為解決臨床治療效果不佳的關(guān)鍵所在。該課題利用了脂質(zhì)體法向食管鱗癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染了PA28α的重組表達(dá)載體，進(jìn)一步利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)了細(xì)胞的周期和凋亡情況，初步證實(shí)了PA28α在食管鱗癌中過(guò)表達(dá)能夠?qū)C9706細(xì)胞阻滯在S期，并且可以抑制食管鱗癌細(xì)胞株的凋亡，說(shuō)明PA28α可能參與食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展，為進(jìn)一步研究PA28α影響腫瘤細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制提供依據(jù)。

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(2013-09-23收稿 責(zé)任編輯趙秋民)

Effects of proteasome activator PA28α on apoptosis and cell cycle of ESCC cells

1)SchoolofLifeSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001 2)LaboratoryforCellBiology,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

PA28α；ESCC；cell cycle；cell apoptosis

Aim: To investigate the effects of PA28α on apoptosis and cell cycle of ESCC. Methods: A recombinant vector pCMV-Myc-PA28α was constructed and then transfected into ESCC cell lines EC9706 and Eca109 cells using LipofectaminTM2000. ESCC cells transfected with pCMV-Myc were served as control. The subcellular localization of PA28α was observed using immunofluorescence. The protein level of PA28α in transfected cells was examined by Western blot. The effects of PA28α on the apoptosis and cell cycle of ESCC were investigated by Annexin V-FITC/PI Flow Cytometry. Results: The fluorescence of PA28α protein was detected mainly in the cytoplasm of ESCC cells. Compared with the control group, the protein expression of PA28α in EC9706 cells transfected with pCMV-Myc-PA28α increased significantly(F=984.411,P<0.001).Compared with the control group,the numder of EC9706 cells in S phase transfected with pCMV-Myc-PA28α inereased as well(F=24.592,P<0.001).The apoptosis cells proportion of the cells transfected with pCMV-Myc-PA28α was much lower than the control group(F=1 448.569,P<0.001). Conclusion: PA28α serves as a key componant in ESCC, which may be a potential therapeutic target for ESCC.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.04.001

*國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 30700140；科技部國(guó)際科技合作基金資助項(xiàng)目 2007DFA01240

R735.1