王 莉 張敏龍 金發(fā)光

淹溺是導(dǎo)致意外死亡的一個重要原因，特別在15歲以下青少年意外死亡中占有很大比例[1]。急性肺損傷(acute lung injury, ALI)是淹溺對機(jī)體造成的最主要的傷害之一，其中海水較淡水淹溺肺損傷更為嚴(yán)重，也更容易發(fā)展成為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)。海水淹溺肺損傷中同時存在缺氧和高滲因素，而這兩個因素常誘導(dǎo)自噬的產(chǎn)生[2-4]。

自噬(autophagy) 被稱為Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡，這種形式的細(xì)胞死亡表現(xiàn)為細(xì)胞漿中出現(xiàn)大量包裹著細(xì)胞漿和細(xì)胞器的空泡結(jié)構(gòu)和溶酶體對空泡內(nèi)成分的降解[5]。自噬在細(xì)胞的生長、發(fā)育和疾病發(fā)生中起著重要的作用。Beclin 1 是自噬的調(diào)控基因，是自噬的關(guān)鍵分子之一[6]，也可對細(xì)胞的自噬活性進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測和判斷。3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine, 3-MA)是磷脂酰肌醇3激酶的抑制劑，可特異性阻斷自噬中自噬體的形成，被廣泛用作自噬的抑制劑。

凋亡(apoptosis)是Ⅰ型程序性細(xì)胞死亡，參與許多重要的生理和病理過程，與自噬共同維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。近年來，內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞凋亡在ALI發(fā)病過程中的作用日益受到重視[7-8]。本實驗擬通過檢測自噬與凋亡指標(biāo)來判斷海水淹溺型肺損傷中自噬與凋亡的關(guān)系。

材料和方法

一、 實驗試劑

地塞米松和3-MA 購自 sigma 公司。地塞米松用5‰羧甲基纖維素鈉(sodium carboxymethyl cellulose)溶液制成混懸液腹腔注射，3-MA溶于PBS制成懸液腹腔注射。配方海水按照中國國家海洋局第三海洋研究所海洋生化研究室提供的我國東南沿海海水的主要成分配制：NaCl 26.518 g/L，MgSO43.305 g/L，MgCl22.447 g/L，CaCl21.141 g/L，NaHCO30.202 g/L，KCl 0.725 g/L，NaBr 0.083 g/L；pH 8.2，相對密度1.05，滲透壓1300 mmol/L。大鼠Beclin1、Bax及β-actin mRNA引物由Invitrogen Custom Primers公司合成。Beclin1抗體、Bax抗體及β-actin抗體購自Abcam公司。ECL增強化學(xué)發(fā)光劑購自美國Pierce公司。其他試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

二、實驗動物及分組

健康雄性SD大鼠40只，清潔級，體重220 g左右，由第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供。采用完全隨機(jī)方法將實驗大鼠分為5組，即正常對照組、海水處理1、3、6、12 h組，每組8只。

三、細(xì)胞培養(yǎng)及處理

A549細(xì)胞用含有100 U/ml青鏈霉素和10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液在5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃進(jìn)行培養(yǎng)。將上述培養(yǎng)的細(xì)胞分為4組，A為正常對照組，B為海水組，C為地塞米松+海水處理組，D為3-MA處理組。給B、C、D分別加入25%海水(1 ml培養(yǎng)液中含0.25 ml海水)，12 h后，C和D分別加入10-6M地塞米松、5×10-3M 3-MA，分別測量Beclin 1和Bax蛋白含量。

四、檢測指標(biāo)及方法

1.肺組織病理學(xué)檢查：取各組大鼠左下肺組織迅速放入4%多聚甲醛固定24 h，脫水，石蠟包埋，切片，蘇木精—伊紅染色法( hematoxylin-eosin staining，HE)染色，光學(xué)顯微鏡觀察。

2.肺濕干比(W/D)檢測： 取每只大鼠相同肺組織，擦干表面血液及水分后電子天平稱濕重，置于75 ℃烤箱內(nèi)烘烤72 h至恒重后稱干重，計算肺組織W/D比值。

3.Westen blot檢測

(1)檢測組織 Beclin 1的蛋白表達(dá)：取各組大鼠右肺下葉200 mg組織勻漿，常規(guī)裂解提取蛋白，定量煮15 min, 12%聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干法轉(zhuǎn)蛋白至NC膜，5%脫脂 奶粉室溫封閉2 h，Beclin 1抗體(1︰1000)和β-actin抗體(1︰500)，4 ℃孵育過夜； TBST洗膜，二抗37 ℃置搖床孵育2 h，TBST洗膜，ECL發(fā)光試劑盒顯影。凝膠圖像分析系統(tǒng)檢測各目標(biāo)條帶的灰度值，計算目的蛋白與β-actin的灰度比。

(2)檢測A549細(xì)胞Beclin 1和Bax的蛋白表達(dá)：將處理過的細(xì)胞用PBS洗滌，然后常規(guī)裂解提取蛋白，定量煮15 min, 12%聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干法轉(zhuǎn)蛋白至NC膜，5%脫脂 奶粉室溫封閉2 h，Beclin 1抗體(1︰1000)，Bax抗體(1︰1000)及β-actin抗體(1︰5 00)，4 ℃孵育過夜； TBST洗膜，二抗37 ℃置搖床孵育2 h，TBST洗膜，ECL發(fā)光試劑盒顯影。凝膠圖像分析系統(tǒng)檢測各目標(biāo)條帶的灰度值，計算目的蛋白與β-actin的灰度比。

五、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、 病理學(xué)檢測結(jié)果

正常對照組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁薄，肺泡腔及支氣管腔內(nèi)僅見少量炎性細(xì)胞及滲出；海水組肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡間隔明顯增厚，肺泡間隔及肺泡腔多見片狀出血，肺泡間質(zhì)和肺泡腔內(nèi)有較多炎性細(xì)胞浸潤。病理變化程度隨海水時間增加而逐漸加重，見圖1。

注：A：正常對照組；B: 海水1 h組；C：海水3 h組；D：海水6 h組；E：海水12 h組

二、 肺組織W/D檢測結(jié)果

海水1 h組W/D比值顯著高于正常對照組(P<0.001)，隨海水注入后時間的增加而逐漸降低，見圖2。

注：***P<0.001、**P<0.01、*P<0.05 vs. 正常對照組

三、Western blot檢測結(jié)果

1. 與正常對照組比較，海水組大鼠肺組織中Beclin1蛋白表達(dá)明顯升高，隨海水注入時間增加，表達(dá)量呈逐漸升高的趨勢。表明海水確實可以引起大鼠肺組織Beclin 1蛋白表達(dá)上調(diào)，見圖3。

2.與正常對照組相比，體外實驗海水組Beclin 1表達(dá)明顯升高(P<0.001﹚；與海水組相比，地塞米松組Beclin 1表達(dá)明顯升高(P<0.001)，3-MA組表達(dá)降低(P<0.01﹚，表明地塞米松可以使Beclin 1表達(dá)升高，見圖4。

3. 與海水組對比，地塞米松組Bax的表達(dá)下降(P<0.01)；與3-MA組相比，地塞米松組Bax表達(dá)明顯下降(P<0.001)，表明地塞米松可以降低Bax蛋白表達(dá)，見圖5。

注：***P<0.001、**P<0.01、*P<0.05 vs. 正常對照組

注：A：正常對照組；B：12 h海水組；C：地塞米松組+12 h海水組；D：3-MA+12 h海水組；***P<0.001 vs. 正常對照組；##P<0.01 vs. 海水12 h組

注：正常對照組；B：12 h海水組；C：地塞米松組+12 h海水組；D：3-MA+12 h海水組;**P<0.01 vs. 12 h海水組；###P<0.001 vs. 3-MA+海水12 h組

討 論

淹溺發(fā)生時溺者常因被迫吸入少量水而導(dǎo)致喉痙攣和低氧血癥，而較長時間的低氧血癥可使喉痙攣逐漸緩解，進(jìn)而吸入大量的水入肺，所以炎癥反應(yīng)和肺水腫是吸入型肺損傷的主要病理生理變化。在本研究中，我們觀察到海水吸入后，大鼠肺泡腔及肺泡間隔有片狀出血以及大量炎細(xì)胞浸潤，隨著時間的增加，大鼠肺組織炎癥浸潤加重。而肺組織在海水吸入1 h時水腫最重，隨后水腫程度逐漸減輕。

自噬是一種在真核細(xì)胞中普遍存在的“自我吞食”現(xiàn)象，在營養(yǎng)缺乏、缺氧、病原體感染、使用抗癌藥物等應(yīng)激條件下，細(xì)胞通過自身的溶酶體系統(tǒng)降解細(xì)胞器和/或大分子物質(zhì)(長壽命蛋白質(zhì))，從而為細(xì)胞生存提供能量和營養(yǎng)物質(zhì)，以達(dá)到維持細(xì)胞正常代謝和生存的目的[9]。研究表明在缺氧過程中，低氧可以激活BNIP3，Beclin 1和其他自噬基因表達(dá)上調(diào)。當(dāng)BNIP3過度表達(dá)時，Bcl-2/Beclin 1復(fù)合體解離并釋放出Beclin 1，最終ClassIUPI3K激活細(xì)胞自噬[10]。在本實驗中,通過westen blot檢測Beclin 1蛋白的表達(dá)，可以看出在海水吸入后，Beclin 1蛋白表達(dá)逐漸升高，表明自噬在海水吸入后被誘導(dǎo)。

地塞米松為急性肺損傷中常用治療藥物，可以通過減少髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)及腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)在肺內(nèi)的聚集來降低海水淹溺性肺損傷的肺泡出血和炎細(xì)胞浸潤，以及減少血管外肺水分和肺上皮-內(nèi)皮細(xì)胞屏障的通透性，上調(diào)表面蛋白-A(surface proteins-A, SPA)和Na+通道的表達(dá)，并且增加Na+/K+-ATPase的活化和Na+/K+-ATPase-α1蛋白含量[11-12]。有資料顯示，地塞米松可以誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞自噬，雖然機(jī)制仍然沒有明確闡明，通過基因表達(dá)分析，地塞米松誘導(dǎo)編碼應(yīng)激蛋白基因的表達(dá)不同，簡稱為DIG2，RTP801，或 REDD1。Molitoris等[13]認(rèn)為在T淋巴細(xì)胞中，糖皮質(zhì)激素可以通過下調(diào)Src激酶Fyn和抑制IP3介導(dǎo)的鈣信號來促進(jìn)自噬。

凋亡是由基因控制的程序性細(xì)胞死亡，與自噬無論在形態(tài)學(xué)方面，還是生化代謝途徑都有顯著的差異。經(jīng)研究證明，二者具有功能上的差別，其關(guān)系可以分為三類，即: ①自噬為凋亡所需，自噬通常先于凋亡，進(jìn)而啟動凋亡；②自噬抑制凋亡，保護(hù)細(xì)胞：自噬可保護(hù)細(xì)胞免于發(fā)生凋亡和壞死；③自噬向凋亡轉(zhuǎn)化，共同促進(jìn)細(xì)胞死亡[14]。本實驗中，我們給海水處理過的細(xì)胞中加入地塞米松和自噬抑制劑3-MA，通過westen blot檢測Beclin 1蛋白及Bcl家族的Bax蛋白發(fā)現(xiàn)，地塞米松組的Beclin 1蛋白表達(dá)明顯高于正常對照組、海水組和3-MA組，表明地塞米松可以上調(diào)Beclin 1蛋白的表達(dá)。而地塞米松組Bax蛋白的表達(dá)則低于海水組和3-MA組，表明凋亡被抑制?？梢娫诒緦嶒炛?，地塞米松可以通過上調(diào)自噬的表達(dá)，進(jìn)而抑制凋亡的發(fā)生。

參 考 文 獻(xiàn)

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