咼恒娟 李津娜 陳寶元 曹 潔 馮 靖 楊曉燕 姜君男

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(obstructive sleep apnea hypopnea syndrome, OSAHS)是指在睡眠期反復(fù)發(fā)生上氣道阻塞并引起呼吸暫停的一種常見病。該病睡眠時(shí)反復(fù)出現(xiàn)呼吸暫停，伴隨不同程度的間歇低氧(intermittent hypoxia, IH)[1]。OSAHS是一種全身系統(tǒng)性疾病，炎癥和氧化應(yīng)激是其主要特征，大量研究表明，白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的激活與相互作用是誘導(dǎo)炎癥和損傷血管的重要因素，導(dǎo)致了心血管并發(fā)癥的發(fā)展[2]。目前認(rèn)為動(dòng)脈粥樣硬化是一個(gè)多環(huán)節(jié)參與的慢性炎癥性疾病，具有自身免疫的特征，涉及多種可溶性介質(zhì)、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的相互作用，其中白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附是動(dòng)脈粥樣硬化形成的始動(dòng)環(huán)節(jié)[3]。在OSAHS模式下，間歇低氧激活淋巴細(xì)胞，被激活的淋巴細(xì)胞表達(dá)黏附分子、細(xì)胞因子及釋放細(xì)胞毒素，與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附增加，加重內(nèi)皮細(xì)胞損傷，加速動(dòng)脈硬化的形成。因此淋巴細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的激活和相互作用在誘導(dǎo)炎癥和損傷內(nèi)皮中占重要作用[4]。

目前認(rèn)為OSAHS模式IH可延遲中性粒細(xì)胞的凋亡，從而加重中性粒細(xì)胞對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷[5]，但I(xiàn)H對(duì)淋巴細(xì)胞亞群的凋亡有何影響尚不清楚，本研究模擬OSAHS建立IH大鼠模型，觀察IH模型大鼠淋巴細(xì)胞亞群的凋亡狀態(tài)，旨在為闡明OSAHS導(dǎo)致內(nèi)皮損傷的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

一、試劑與材料

研究試劑與材料： ①Wistar大鼠由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供；②Tempol及Histopaque雙密度梯度分離液 (Sigma-Aldrich)；③抗體(Becton Dickinson)；④臺(tái)盼藍(lán)染液 (上海迪申生物技術(shù)有限公司)；⑤吉姆薩染液 (南京建成科技有限公司)；⑥混合氣(天津六方氣體有限公司)；⑦全無油潤滑空氣壓縮機(jī)(上海捷豹壓縮機(jī)制造有限公司丹崖分公司)；⑧醫(yī)用型氧濃度分析儀(建德市梅城電化分析儀器廠)；⑨空氣凈化器(浙江溫嶺市澤國空壓機(jī)有限公司)；⑩流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson)。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1. 大鼠分組及IH干預(yù)：將16只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為2組,每組8只：①常氧對(duì)照組(normal oxygen, NC)：向低氧艙內(nèi)持續(xù)充入壓縮空氣(流速6 L/min)，使氧艙內(nèi)氧濃度始終維持在21%；②IH 4周組(IH4)：間歇低氧頻率為30次/h，低氧艙內(nèi)最低氧濃度為5%，向低氧艙內(nèi)循環(huán)充入純氮?dú)?0 s(流速10 L/min)，壓縮空氣50 s(流速16 L/min)使艙內(nèi)氧濃度恢復(fù)，壓縮空氣40 s(流速6 L/min)常氧維持，每2 min為1循環(huán)，使低氧艙內(nèi)氧濃度在5%～21%間循環(huán)，達(dá)到低氧-復(fù)氧的目的。

2. 淋巴細(xì)胞的分離：暴露4周結(jié)束后，各組大鼠均于清晨空腹給予3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血后收集肝素抗凝血液標(biāo)本8～10 ml。使用雙層Ficoll-Histopaque (Histopaque 1.083和1.119)雙密度梯度離心法分離淋巴細(xì)胞，按廠家說明書操作。將純化的淋巴細(xì)胞在無血清RPMI-1640培養(yǎng)基中重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml。臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)算所分離淋巴細(xì)胞的存活率，吉姆薩染色確定其純度。

3. 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)大鼠外周血CD4 T、CD8 T、NK、B細(xì)胞的凋亡情況: 使用冰PBS緩沖液洗細(xì)胞2次，再用1×Binding Buffer緩沖液重懸為1×106/ml的懸液，標(biāo)號(hào)試管1-4，1號(hào)試管加CD45RA FITC-Ab 5 μl，2號(hào)試管同時(shí)加CD3 APC-Ab和CD4 FITC -Ab 5μl，3號(hào)試管同時(shí)加CD3 APC-Ab和CD8 a FITC-Ab 5 μl，4號(hào)試管同時(shí)加CD3 APC-Ab和CD161 a FITC-Ab 5μl，向每個(gè)試管中加入100 μl細(xì)胞懸液(1×106/ml)。4 ℃避光孵育15 min，向每只試管中均加入凋亡緩沖液1 ml，以離心半徑8 cm，1500 r/min離心 10 min，洗滌5 min，棄上清并向每只試管中加100 μl凋亡緩沖液，并同時(shí)加入5 μl的Annexin V PE和5 μl的7-AAD。輕輕混勻，于室溫(20～25 ℃)避光放置15 min。向每個(gè)試管中加入1×Binding Buffer緩沖液400 μl，于1 h內(nèi)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

如圖1和2所示，IH組CD4 T細(xì)胞凋亡率(15.17±1.43)%低于NC組(17.97±1.76)%，CD8 T細(xì)胞凋亡率(17.23±1.07)%低于NC組(19.71±1.93)%，NK細(xì)胞凋亡率(22.07±1.45)%高于NC組(17.33±1.04)%，B細(xì)胞凋亡率(17.88±1.85)%高于NC組(13.94±1.76)% (P均<0.01)。

注：A：CD4 T細(xì)胞；B：CD8 T細(xì)胞；C：NK淋巴細(xì)胞；D：B淋巴細(xì)胞

注：*P<0.01 vs. 對(duì)照組

討 論

OSAHS是一種伴隨心血管疾病嚴(yán)重后果的常見疾病，具有誘發(fā)高致死性和非致死性心血管事件的風(fēng)險(xiǎn)，與心血管疾病的發(fā)病率和病死率相關(guān)。OSAHS心血管并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，可能與多因素交互作用有關(guān)。OSAHS可促進(jìn)氧化應(yīng)激的產(chǎn)生以及炎性細(xì)胞的激活[5]。白細(xì)胞的激活以及其與內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用，可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，進(jìn)一步誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展[4]。Dyugovskaya等[6]研究發(fā)現(xiàn)OSAHS患者的中性粒細(xì)胞凋亡延遲，并可進(jìn)一步加重炎性反應(yīng)和內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。但目前睡眠呼吸暫停模式間歇低氧對(duì)大鼠外周血淋巴細(xì)胞亞群凋亡的影響鮮有報(bào)道。本研究表明，IH對(duì)淋巴細(xì)胞亞群的凋亡具有不同的調(diào)節(jié)作用，IH可延遲CD4、CD8 T細(xì)胞的凋亡，但可加速NK和B細(xì)胞的凋亡。

T細(xì)胞作為炎性細(xì)胞在IH誘導(dǎo)的內(nèi)皮功能障礙中發(fā)揮著重要的作用，在OSAHS患者中，T細(xì)胞可通過浸潤直接損傷或通過炎癥因子的釋放損傷內(nèi)皮細(xì)胞。Dyugovskaya等[7-9]通過流式細(xì)胞儀和鉻釋放方法，發(fā)現(xiàn)OSAHS患者的CD4、CD8和γδ T細(xì)胞有細(xì)胞顯型和功能的改變，造成對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的毒性顯著增加。本研究顯示IH可導(dǎo)致CD4、CD8 T細(xì)胞凋亡減少，即CD4、CD8 T細(xì)胞生存期延長，其可能是累積炎性和毒性細(xì)胞的一種機(jī)制，進(jìn)而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。Gaber等[10]研究表明病理性低氧(<2% O2)可顯著降低人CD4 T細(xì)胞的存活，而生理低氧(5% O2)并不降低其存活，這與我們的研究結(jié)果并不一致。因此，低氧對(duì)CD4 T細(xì)胞存活的影響可能與低氧模式、低氧濃度以及細(xì)胞株類型相關(guān)。

NK細(xì)胞在動(dòng)脈硬化的過程中亦發(fā)揮著重要作用。正常情況下，NK細(xì)胞能夠控制感染和自身免疫性疾病。NK細(xì)胞功能的喪失可能會(huì)使機(jī)體易于感染動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的病原體，從而導(dǎo)致斑塊負(fù)擔(dān)增加和易損斑塊的形成[11]。此外，NK細(xì)胞減少可能會(huì)導(dǎo)致機(jī)體在免疫防御、免疫監(jiān)視及免疫自身穩(wěn)定功能等方面的下降，從而導(dǎo)致一系列疾病如腫瘤等發(fā)生率的增高。本研究顯示IH可導(dǎo)致大鼠外周血NK細(xì)胞的凋亡增加，可能促使機(jī)體對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)病原體的易感性，從而加重動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。此外亦有文獻(xiàn)報(bào)道[12-15]，OSAHS患者的腫瘤發(fā)病率和病死率明顯升高，其可能與NK細(xì)胞的凋亡率增加相關(guān)。IH促使NK細(xì)胞凋亡增加的機(jī)制尚不清楚，Hansson等[16]研究證實(shí)，外源性H2O2可促使NK細(xì)胞凋亡，但加入H2O2清除劑后凋亡降低，提示NK細(xì)胞的凋亡與氧化應(yīng)激相關(guān)。本研究中，IH激發(fā)的氧化應(yīng)激是否參與了NK細(xì)胞的凋亡，尚有待進(jìn)一步的研究。B細(xì)胞參與動(dòng)脈硬化的發(fā)展，基于B細(xì)胞的亞型不同，具有抗動(dòng)脈硬化與促動(dòng)脈硬化的雙重效應(yīng)[17]，其作用較復(fù)雜。本研究中IH促使B細(xì)胞凋亡增加，但其真正的臨床意義尚不明確。

本實(shí)驗(yàn)?zāi)MOSAHS導(dǎo)致的IH，研究其對(duì)大鼠外周血淋巴細(xì)胞亞群凋亡的影響。結(jié)果表明IH對(duì)CD4、CD8 T細(xì)胞以及NK、B細(xì)胞的凋亡表現(xiàn)出不同的調(diào)節(jié)作用，可導(dǎo)致免疫細(xì)胞的凋亡紊亂和功能異常，對(duì)OSAHS患者相關(guān)的疾病如動(dòng)脈粥樣硬化和腫瘤可能具有一定的臨床意義，值得關(guān)注并進(jìn)一步深入研究。

參 考 文 獻(xiàn)

1 Bradley TD, Floras JS. Obstructive sleep apnoea and its cardiovascular consequences[J]. Lancet, 2009, 373(9657): 82-93.

2 李津娜, 陳寶元. 慢性間歇低氧對(duì)外周血細(xì)胞影響的研究進(jìn)展[J]. 中華結(jié)核與呼吸雜志, 2014, 37(2)：113-114.

3 Arnaud C, Dematteis M, Pépin JL, et al. Obstructive sleep apnea syndrome, immuno-inflammation and atherosclerosis[J]. Semin Immunopathol, 2009, 31(1): 113-125.

4 Lavie L, Dyugovskaya L, Polyakov A. Biology of peripheral blood cells in obstructive sleep apnea-the tip of the iceberg[J]. Arch Physiol Biochem, 2008, 114(4): 244-254.

5 黃寧俠, 李鴻昌, 師 琨. 阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征患者氧化-抗氧化狀態(tài)及夜間無創(chuàng)通氣的干預(yù)作用[J/CD]. 中華肺部疾病雜志: 電子版, 2013, 6(2): 139-143.

6 Dyugovskaya L, Polyakov A, Lavie P, et al. Delayed neutrophil apoptosis in patients with sleep apnea[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2008, 177(5): 544-554.

7 Dyugovskaya L, Lavie P, Lavie L. Phenotypic and functional characterization of blood γδ T cells in sleep apnea[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2003, 168(2): 242-249.

8 Dyugovskaya L, Lavie P, Lavie L. Lymphocyte activation as a possible measure of atherosclerotic risk in patients with sleep apnea[J]. Ann NY Acad Sci, 2005, 1051: 340-350.

9 Dyugovskaya L, Lavie P, Hirsh M, et al. Activated CD8+ T-lymphocytes in obstructive sleep apnoea[J]. Eur Respir J, 2005, 25(5): 820-828.

10 Gaber T, Tran CL, Schellmann S, et al. Pathophysiological hypoxia affects the redox state and IL-2 signalling of human CD4+ T cells and concomitantly impairs survival and proliferation[J]. Eur J Immunol, 2013, 43(6): 1588-1597.

11 Jonasson L, Backteman K, Ernerudh Jan. Loss of natural killer cell activity in patients with coronary artery disease[J]. Atherosclerosis, 2005, 183(2): 316-321.

12 Campos-Rodriguez F, Martinez-Garcia MA, Martinez M, et al. Association between obstructive sleep apnea and cancer incidence in a large multicenter Spanish cohort[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2013, 187(1): 99-105.

13 Christensen AS, Clark A, Salo P, et al. Symptoms of sleep disordered breathing and risk of cancer: a prospective cohort study[J]. Sleep, 2013, 36(10): 1429-1435.

14 Chen JC, Hwang JH. Sleep apnea increased incidence of primary central nervous system cancers: a nationwide cohort study[J]. Sleep Med, 2014, 15(7): 749-754.

15 Gozal D, Almendros I, Hakim F. Sleep apnea awakens cancer: A unifying immunological hypothesis. Oncoimmunology[J]. 2014, 3: e28326.

16 Hansson M, Asea A, Ersson U, et al. Induction of apoptosis in NK cells by monocyte-derived reactive oxygen metabolites[J]. J Immunol, 1996, 156(1): 42-47.

17 Perry HM, McNamara CA. Refining the role of B cells in atherosclerosis[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2012, 32(7):1548-1549.