趙吉睿，鞏瑞紅，，， ，勿力吉瑪，，*

(1：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學生命科學學院應(yīng)用與環(huán)境微生物研究所，呼和浩特 010018) (2：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學水利與土木建筑工程學院，呼和浩特 010018) (3：內(nèi)蒙古自治區(qū)赤峰市喀喇沁旗錦山鎮(zhèn)人民政府，赤峰 024400)

好氧不產(chǎn)氧光合細菌(Aerobic anoxygenic phototrophic bacteria， AAPB)是在有氧條件下以有機物、硫化物或氨等作為供氫體，通過細菌葉綠素捕獲光能進行光合作用但并不釋放氧氣的一類原核生物[1]. AAPB廣泛分布于海洋、熱泉、河流、內(nèi)陸湖泊等各種環(huán)境[2].其生物量占整個微生物群落的比例，在海洋中約為11%，在河口中最高可達34%，而在一些高山湖泊中的比例甚至超過了50%[3-4].

AAPB營光合異養(yǎng)的營養(yǎng)方式：溶解有機質(zhì)(DOM)作為有機碳的來源維持生長代謝，同時它作為具有光合作用功能的細菌，以光合作用作為異養(yǎng)代謝的能量補充.因此，AAPB在水體碳循環(huán)中起著重要作用[3].AAPB可利用的碳源十分豐富，如有機酸、碳水化合物、乙醇和復(fù)雜的有機體等[5].葡萄糖、丙酮酸鈉和酵母提取物常用作AAPB分離和培養(yǎng)的碳源，且培養(yǎng)效果較好[6].然而，這些碳源對AAPB群落結(jié)構(gòu)的影響究竟如何尚不清楚.本研究通過對內(nèi)蒙古高原湖泊烏梁素海水體分別添加葡萄糖、丙酮酸鈉及酵母提取物進行室內(nèi)誘導(dǎo)實驗，以分析AAPB在經(jīng)3種碳源誘導(dǎo)后群落結(jié)構(gòu)的變化，為理解AAPB廣泛的環(huán)境適應(yīng)性、在碳循環(huán)中的作用及其菌種的分離和培養(yǎng)提供依據(jù).

烏梁素海(40°47′～41°03′N，108°43′～108°57′E)，位于內(nèi)蒙古西部巴盟烏拉特前旗境內(nèi)，屬淺水湖泊(平均水深約1.0m，最深約2.5m)，南北長約35～40km，東西寬約5～10km，湖面平均高程約為1018.5m，湖泊容量為2.5×108～3.3×108m3，湖面海拔1018.79m，現(xiàn)有水域面積約293km2，湖水最終由最南端匯入黃河，是黃河流域最大的湖泊，是地球上同緯度地區(qū)最大的自然濕地(已列入世界濕地公約).由于地處冬季寒冷干燥、夏季炎熱少雨的全球半荒漠地區(qū)，烏梁素海成為了我國北方重要的生態(tài)屏障，在維持地區(qū)的生態(tài)平衡、保護物種的多樣性方面起著舉足輕重的作用[7].

1 材料和方法

1.1 樣品采集、碳源添加和培養(yǎng)

于2010年8月內(nèi)蒙古烏梁素海污染較嚴重的紅圪卜湖區(qū)(HGB)(圖1)采集表層(0～20cm)水樣[8].樣品置于低溫(4℃)迅速運回實驗室，分別在500ml三角瓶中分裝入300ml水樣.之后，分別添加葡萄糖、丙酮酸鈉、酵母提取物3種碳源，至其在分裝水樣中總濃度分別均達到0.5g/L.每種碳源添加處理分別設(shè)置6個平行進行培養(yǎng).樣品編號如下：對照組(N0、N7、N14、N21)，加葡萄糖組(G7、G14、G21)，丙酮酸鈉組(B7、B14、B21)，酵母提取物組(Y7、Y14、Y21)，編號中的數(shù)字代表取樣時的培養(yǎng)天數(shù).培養(yǎng)條件為：28℃恒溫，光暗周期為14h∶10h.

圖1 烏梁素海采樣點分布Fig.1 Distribution of sampling site in Lake Ulansuhai

1.2 細菌過濾收集

分別在培養(yǎng)0、7、14和21d后于超凈臺中從各平行樣中取出50ml水樣，添加同種碳源的水樣混合后過濾.樣品過濾時先用10μm孔徑的濾膜(所有濾膜均為美國Millipore公司生產(chǎn)，直徑45mm)過濾以去除顆粒雜質(zhì)以及真核生物，隨后用0.22μm濾膜過濾，每張膜過濾100ml水樣.將過濾好的濾膜用鋁箔紙包好，經(jīng)液氮速凍后放入-70℃保存?zhèn)溆?而取樣后將剩余培養(yǎng)液置于1.1節(jié)中所述培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng).

1.3 樣品總DNA的提取及PCR擴增

在超凈臺中用經(jīng)灼燒滅菌的剪刀將上述凍存的濾膜剪成小碎片(大小約1mm×1mm)，裝入10ml離心管之后參考Bostr?m等[11]的方法，采用酶解和反復(fù)凍融結(jié)合法提取DNA.以提取的總DNA為模版，用F341-GC(5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTAGGGAGGCAGCAG-3′)及R907(5′-CCGTCAATTCMTTTGAGTTT-3′)引物擴增16S rDNA V3～V5區(qū)片段.用特異性引物UNIF(5′-GGNAAYYTNTWYTAYAAYCCNTTYCA-3′)及GC-WAW(5′-CCGCCGCGCGGCGGGCGGGGGGGGGCACCGGGGAYNGCRA-ACCACCANGCCCA-3′)擴增pufM片段[12].2個片段的PCR反應(yīng)體系為：2μl DNA模板(約50ng/μl)，0.4μl Easy-Taq酶，5μl擴增Buffer，4μl dNTP(20mmol/L)，引物(20μmol/L)各0.5μl，Mg2+終濃度為3mmol/L，補水使總體積至50μl.

使用梯度PCR儀(Veriti9026，ABI，Germany)進行目的基因擴增.16S rDNA片段擴增條件為：94℃預(yù)變性5min；每個循環(huán)為94℃下變性1min，55℃下退火1min，72℃延伸1min，共30個循環(huán)；最后，在72℃下延伸10min.pufM片段擴增條件為：94℃預(yù)變性3min；每個循環(huán)為94℃下變性30s，50℃下退火45s，72℃延伸45s，共35個循環(huán)；最后，在72℃下延伸10min.2個基因的擴增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測.

1.4 變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析

運用基因突變檢測儀(Dcode，Bio-rad，US)對16SrDNA[10]及pufM基因[11]進行DGGE分析：聚丙烯酰胺凝膠濃度為6%(用于16S rDNA分析)或8%(用于pufM基因分析)，電泳緩沖液為1×TAE，變性梯度為45%～60%；PCR產(chǎn)物上樣量為300ng DNA；電壓80V，60℃，電泳13h；用0.2%硝酸銀溶液染色15min，后用Gel DocTM EQ imager (Bio-Rad)成像拍照.

1.5 DGGE條帶的序列測定及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

用無菌刀片切割DGGE凝膠中的DNA條帶，將切下后的不同條帶分別放入1.5ml EP管中，以無菌去離子水沖洗5遍后，在EP管中加入40μl無菌水、置于4℃過夜，以使膠中的DNA溶出.之后，輕微振蕩混勻再在1000轉(zhuǎn)/min低速離心，吸取1μl上清液作為模板，用不含GC夾的引物，以與1.2節(jié)中相同的擴增程序及體系進行擴增.將純化后的PCR產(chǎn)物與pEASY-T1載體連接，并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，將陽性克隆送北京華大生物技術(shù)有限公司用ABI 3730XL型測序儀進行測序.手動去除載體序列，將有效序列在NCBI上進行比對，以其中同源性最高的序列確定為參比菌株，并用Mega 5.1軟件，基于Kimura-2參數(shù)模型計算進化距離；用鄰接法(Neighbor Joining Method)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹[13]，重復(fù)驗證數(shù)為1000.

1.6 細菌群落多樣性的統(tǒng)計學分析

應(yīng)用Quantity One 4.4.0(Bio-Rad)對DGGE電泳圖譜進行聚類分析，比較不同樣品中菌群的基因型差異；香農(nóng)-威納多樣性指數(shù)(Shannon-Wiener指數(shù)，H′)、豐富度(R)和均勻度指數(shù)(EH)被用來比較各個樣品的細菌多樣性[14]，計算公式分別為：

(1)

R=S

(2)

EH=H′/Hmax=H′/lnS

(3)

式中，Pi是某個樣品中i條帶的強度占所有條帶總強度的比率，S是某個樣品中所有條帶數(shù)目總和.

2 結(jié)果

2.1 DGGE圖譜和群落多樣性指數(shù)分析

16S rDNA的DGGE圖譜分析表明，所有樣品可分離到15～25條條帶(圖2a).葡萄糖誘導(dǎo)21d的樣品條帶數(shù)最少，為15條；丙酮酸鈉誘導(dǎo)7d的樣品條帶數(shù)最多，為25條，各樣品條帶豐富度差異較大(表1).碳源誘導(dǎo)后烏梁素海水樣菌群多樣性變化趨勢與豐富度的變化趨勢類似，其中7～14d誘導(dǎo)過程中，丙酮酸鈉誘導(dǎo)后水體總細菌Shannon-Wiener指數(shù)從3.037升至3.324，提高了約10%，在3種碳源中提高幅度最大；其次為葡萄糖，從3.160升至3.359，提高約8%.不同時期對照樣品的均勻度指數(shù)(EH)均較高，在添加碳源后各樣品均勻度指數(shù)相比對照均略有下降，但在21d時恢復(fù)至0.91～0.96(表1).

a b

圖2 水體樣品中細菌16S rDNA基因(a)和pufM基因(b)DGGE圖譜(圖譜上端字母和數(shù)字為樣品編號：N代表未添加任何碳源；B、G和Y分別代表添加丙酮酸鈉、葡萄糖和酵母提取物；數(shù)字代表相應(yīng)取樣時的培養(yǎng)天數(shù)；條帶1～12為切膠回收條帶)Fig.2 DGGE profile of bacterial 16S rDNA(a) and pufM(b) in water samples(The symbols on the top： N represents nothing added； B， G and Y indicate the addition of sodium pyruvate， glucose and yeast extracts， respectively； the numbers show the culture days when sampling； Bands 1-12 indicate the excised bands)

表1 細菌16S rDNA基因和pufM基因豐富度、多樣性指數(shù)及均勻度指數(shù)分析

Tab.1 Diversity analysis of samples estimated by 16S rDNA-DGGE and pufM-DGGE bands patterns

樣品16S rDNApufMRH'EHRH'EHN0213.0630.99182.1830.893N7193.0300.99582.0540.879B7253.0370.99771.8430.883G7223.1600.99861.8780.865Y7213.0870.997102.1720.875N14183.3220.99792.1160.866B14183.3240.998152.6150.903G14163.3590.99892.2870.880Y14193.4590.99851.8750.863N21193.4820.99672.1160.864B21203.1180.99882.0150.887G21153.0160.99762.0870.875Y21183.1480.99881.9870.856

pufM基因的DGGE圖譜(圖2b)表明，各樣品條帶數(shù)從5到15條不等，豐富度變化較大. 其中丙酮酸鈉誘導(dǎo)14 d后樣品條帶數(shù)最多，與16S rDNA-DGGE的分析結(jié)果相似. 各樣品細菌多樣性指數(shù)及均勻度指數(shù)均發(fā)生不同程度的變化(表1). 對照樣品的好氧不產(chǎn)氧光合細菌(aerobic anoxygenic phototrophic bacteria， AAPB)群落的Shannon-Wiener指數(shù)在0～21d培養(yǎng)過程中變化不大，而添加丙酮酸鈉及葡萄糖誘導(dǎo)樣品在培養(yǎng)7～21d過程中均呈現(xiàn)先升后降的趨勢，但酵母提取物誘導(dǎo)樣品則表現(xiàn)出先降后升的趨勢. AAPB群落豐富度指數(shù)與Shannon-Wiener指數(shù)變化規(guī)律一致.各樣品的均勻度指數(shù)差別均不大，丙酮酸鈉誘導(dǎo)14d的樣品群落均勻度指數(shù)達0.903，為各樣品中的最高值.

2.2 條帶測序及系統(tǒng)發(fā)育分析

分別選取16S rDNA和pufM的PCR-DGGE指紋圖譜中差異條帶進行切膠回收、測序，最后共得到12條16S rDNA和13條pufM序列.系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果(圖3A)表明，16S-band 1出現(xiàn)在N、Y7、G7、N14、N21、B21、Y21等樣品中，與Paracoccusmarinus相近，該菌是一類分離自海洋環(huán)境，具有產(chǎn)糖能力的好氧細菌[15].在誘導(dǎo)過程中，該條帶在G7、Y7時變?nèi)酰笤贕14、Y14時消失，但至21d時，該條帶又再度出現(xiàn)，且亮度較原始對照樣品有所提升.16S-band 4從原始樣品至7d誘導(dǎo)過程中始終存在，與耐鹽菌Halobacillustrueperi相近，推測與烏梁素海水體的輕微鹽堿性有關(guān).16S-band 6序列與從石油污染海區(qū)分離到的Thalassospiraxianhensis相似，據(jù)報道該菌屬有著降解多環(huán)芳烴的能力[6].16S-band 9、10是在誘導(dǎo)至14d時亮度提升的條帶，并在各種碳源誘導(dǎo)的樣品中均有所出現(xiàn)，經(jīng)比對發(fā)現(xiàn)16S-band 9與Geobacillusstearothermophilus有著99%的同源性，該菌有著降解污染物，利用糖類的能力，推測該條帶的變化與相關(guān)碳源處理有著密切關(guān)系.16S-band 11在N、N7、B14、G14、Y14、B21、Y21這7個樣品中均有出現(xiàn)，條帶亮度在處理過程中其豐富度隨誘導(dǎo)時間的延長略有提升. 比對后發(fā)現(xiàn)該條帶與Pseudoalteromonassp.有99%的相似性，該菌分離自海洋環(huán)境，具有產(chǎn)胞內(nèi)抗菌素的能力.16S-band 5除G7和Y14外的其他樣品中均存在，與UnculturedFlavobacterialesbacterium的相似性為99%，該菌為常見的水生類群.其余的4條帶(16S-band 2、3、9、12)與不可培養(yǎng)菌序列相似，比對發(fā)現(xiàn)均來自湖泊灣口等水體環(huán)境.系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3A)顯示16S rDNA序列在系統(tǒng)發(fā)育樹上全部屬于蛋白菌門(Proteobacteria).分屬于其下所包含的4個亞類群，分別是Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria、Gammaproteobacteria、Deltaproteobacteria. 可知Proteobacteria始終為烏梁素海水體中的優(yōu)勢類群.

pufM基因系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果(圖3B和C)表明，13條pufM序列分屬于Alphaproteobacteria及Gammaproteobacteria兩大類群. 條帶puf-band 1在Y7、G14、G21、Y21均有出現(xiàn)，與Porphyrobactertepidarius有93%的相似性，據(jù)報道該菌屬從熱泉及海洋中均曾分離得到，具有耐熱性，能夠以葡萄糖和酵母提取物作為能量來源[16].puf-band 2在G7、G14、N21中均有所發(fā)現(xiàn)，其序列與自波羅的海分離得到，具有較強產(chǎn)葉綠素能力的Erythromicrobiumsp.的相似性為91%[9].puf-band 8從原始樣品至7 d誘導(dǎo)過程中始終存在且條帶亮度基本不變，至14 d誘導(dǎo)時僅在對照及丙酮酸鈉誘導(dǎo)樣品中出現(xiàn)，之后至21 d時則完全消失；puf-band 10作為原始至7 d誘導(dǎo)樣品的優(yōu)勢條帶，至14 d時僅Y14樣品條帶亮度較弱，其余變化不大，至21 d時則僅在對照樣品中發(fā)現(xiàn)；puf-band 8、10序列均歸屬于Rhodobacter，分別與Rhodobactermegalophilus(96%)和Rhodobacterazotoformans(83%)相似.puf-band 12僅在N、N7、B14中出現(xiàn)，與Allochromatiumsp.相近(92%).puf-band 4、7均與海洋中的不可培養(yǎng)種最相似，puf-band 5與Uncultured WHP231 bacterium clone序列最相似.

相比其他淡水湖的研究[17]，本研究中發(fā)現(xiàn)烏梁素海水體AAPB中Alphaproteobacteria所占比例較高，特別是在丙酮酸鈉及葡萄糖誘導(dǎo)處理后，出現(xiàn)的puf-band 1、2、8、10等條帶均歸類于Alphaproteobacteria. 而在丙酮酸鈉誘導(dǎo)處理14 d后出現(xiàn)的puf-band 12，則歸類于淡水中罕見的Gammaproteobacteria.值得注意的是，puf-band 3、4、6、9在進化樹上不能與其它序列聚在一起(圖3C)，且均與海洋中不可培養(yǎng)菌的序列相近，推測可能是烏梁素海水體中特有的AAPB菌種.

3 討論

3.1 碳源誘導(dǎo)后細菌群落結(jié)構(gòu)變化

Baines等[18]曾提出水體環(huán)境中的可溶碳在與環(huán)境中的微生物作用后將會對水生生態(tài)系統(tǒng)及菌群結(jié)構(gòu)造成影響.本研究發(fā)現(xiàn)，在提升可溶碳濃度后細菌多樣性和豐富度能夠有所提升，這與Tranvik[19]對不同可溶碳濃度的淡水湖泊內(nèi)細菌豐富度的比較研究相一致.葡萄糖誘導(dǎo)后水體菌群豐富度提升幅度很小，可能是由于相對3碳分子化合物丙酮酸鈉而言，等重量6碳分子化合物葡萄糖的碳含量更高，可能并不能對整個細菌群落豐富度起到預(yù)期的提升效果.Imazaki等[20]曾提出，運用以丙酮酸鈉為主碳源的培養(yǎng)基能夠提高淡水湖中細菌的可培養(yǎng)效率，這與本研究結(jié)果相一致.16S rDNA系統(tǒng)進化分析表明，在碳源誘導(dǎo)后出現(xiàn)了Thalassospiraxianhensis、Geobacillusstearothermophilus、Pseudoalteromonassp.等類群，其中Pseudoalteromonassp.僅在丙酮酸鈉誘導(dǎo)樣品中出現(xiàn)，而歸屬于Alphaproteobacteria類群包括Thalassospiraxianhensis和Paracoccusmarinus等菌屬則僅在酵母提取物誘導(dǎo)樣品中出現(xiàn)，推測酵母提取物能夠提升烏梁素海水體中的Alphaproteobacteria類群的豐富度.

3.2 碳源誘導(dǎo)對AAPB群落的影響

圖3 16S rDNA基因(A)和pufM基因(B)序列系統(tǒng)發(fā)育樹，pufM基因簇Group(C)Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA gene(A) and pufM sequences(B) from DGGE bands， and the special group of pufM sequences(C)

基于pufM-DGGE圖譜分析后發(fā)現(xiàn)，丙酮酸鈉和葡萄糖2種碳源誘導(dǎo)后AAPB菌群的豐富度及多樣性指數(shù)均呈現(xiàn)了先升后降的趨勢.丙酮酸鈉誘導(dǎo)后AAPB群落變化與細菌群落相似，豐富度提升了近1倍，多樣性指數(shù)也提高了約15%.葡萄糖添加誘導(dǎo)后豐富度提升50%，多樣性指數(shù)提升約8%.酵母提取物添加后樣品的群落多樣性變化趨勢則有所不同，豐富度下降約40%，體現(xiàn)了與另外2種碳源誘導(dǎo)后樣品相反的變化趨勢.究其原因，可能是其中復(fù)雜的組分所致.相比丙酮酸鈉及葡萄糖這2種碳源，酵母提取物含有氨基酸、肽、核苷酸、維生素等物質(zhì)，其所包含營養(yǎng)成分更為復(fù)雜.然而好氧不產(chǎn)氧光合細菌通常難以適應(yīng)高營養(yǎng)的培養(yǎng)條件，它們更偏好于在低營養(yǎng)條件下進行有效的復(fù)制[5]，例如最早分離的SAR11等類群.因此酵母提取物可能對于偏好寡營養(yǎng)環(huán)境的AAPB而言促生作用并不顯著.21 d時各樣品的豐富度差別很小，可能水體菌群結(jié)構(gòu)已經(jīng)初步達到了穩(wěn)態(tài).pufM基因的系統(tǒng)進化樹(圖3B)顯示，得到的優(yōu)勢條帶序列分屬Alphaproteobacteria及Gammaproteobacteria.據(jù)報道Alphaproteobacteria及Gammaproteobacteria在海區(qū)水體中所占比例較高，淡水環(huán)境中很少能檢測到[21-22]；但本研究中，在碳源誘導(dǎo)后出現(xiàn)了Porphyrobactertepidarius和Rhodobactermegalophilus等菌屬，使Alphaproteobacteria的比例非常高(約65%)；此外，有2條序列(puf-band 7、12)與Thiocapsaroseopersicina相近，其中puf-band 12僅在丙酮酸鈉誘導(dǎo)樣品中檢測到，并且成為了優(yōu)勢類群，因此使得Gammaproteobacteria的比例達到30%.比較3種碳源誘導(dǎo)樣品，發(fā)現(xiàn)Porphyrobactertepidarius，Uncultured WHP231 bacterium clone等為丙酮酸鈉誘導(dǎo)樣品中獨有的類群；Rhodobactermegalophilus和從西藏鹽湖中所得的Uncultured bacterium clone(FJ669186)僅在酵母提取物誘導(dǎo)后樣品中發(fā)現(xiàn)；來自海洋的Unculturedmarine bacterium(FJ623656)則僅在葡萄糖誘導(dǎo)后樣品中發(fā)現(xiàn).究其原因，一方面可能是由于烏梁素海地處河套土壤鹽堿化嚴重的地區(qū)，并且該湖水循環(huán)少、蒸發(fā)量大，使得湖水鹽堿性增加，從而出現(xiàn)了部分僅在高鹽環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的類群；另一方面，則推測是碳源誘導(dǎo)后水體可溶碳與AAPB發(fā)生了互作，水環(huán)境中的可溶碳能夠作為光能源外的營養(yǎng)來源去滿足其生存需求，因此當可溶性碳的電子供體進行呼吸作用時，部分類群AAPB的活性可能會有所變化[5]，致使參與碳循環(huán)的AAPB各類群比重發(fā)生了變化.與之前針對烏梁素海水體AAPB的研究相比[2]，本實驗并未發(fā)現(xiàn)此前比例較高的Betaproteobacteria.一方面可能是由于DGGE技術(shù)仍具有一定局限性，不能完全檢測到環(huán)境中的細菌類群；另一方面，推測是水體環(huán)境中可溶碳濃度的突然升高使得Betaproteobacteria難以耐受，從而導(dǎo)致豐富度下降.

總之，3種碳源能夠使得淡水環(huán)境中細菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生較大變化，特別是能使一些AAPB的功能類群豐度增加，表明碳源種類及環(huán)境中碳素水平與AAPB直接相關(guān)，而丙酮酸鈉作為本研究證實的具有良好誘導(dǎo)效果的碳源，其與AAPB互作機理等尚待進一步研究.

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