何培新等

摘要：采用平板覆蓋玻璃紙培養(yǎng)法，初步探討了甘露醇、二甲基亞砜（DMSO）、苯甲酸鈉和N，N-二甲基對(duì)亞硝基苯胺等4種羥基自由基清除劑， L-半胱氨酸、還原型谷胱甘肽和β-巰基乙醇等3種巰基化合物和抗壞血酸對(duì)粗柄羊肚菌（Morchella crassipes）菌絲生長和菌核發(fā)生的影響。結(jié)果表明，作為可以降低真菌胞內(nèi)氧化應(yīng)激的活性氧自由基清除劑，測試藥劑對(duì)菌絲生長和菌核發(fā)生具有抑制作用，且該抑制作用隨著藥劑濃度的增加而增強(qiáng)，較高濃度的添加藥劑可完全抑制菌核發(fā)生。隨著測試藥劑的羥基自由基清除能力增強(qiáng)，完全抑制粗柄羊肚菌菌核發(fā)生的濃度相應(yīng)降低，菌絲生長也大致表現(xiàn)出類似的趨勢。測試的較強(qiáng)自由基清除劑苯甲酸鈉、N，N-二甲基對(duì)亞硝基苯胺、3種巰基化合物和抗壞血酸改變了粗柄羊肚菌菌落的色澤，表明打破了粗柄羊肚菌正常的生理活動(dòng)。

關(guān)鍵詞：粗柄羊肚菌（Morchella crassipes）；自由基清除劑；氧化應(yīng)激；菌絲生長；菌核發(fā)生

中圖分類號(hào)：S646.7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）13-3085-05

Effects of Oxidative Stress on Mycelial Growth and Sclerotial Metamorphosis

of Morchella crassipes

HE Pei-xin1，LIU Wei2，CAI Ying-li3，MA Ben-jun1，CHEN Lei-tao1，WU Xiao-rui1

（ 1. School of Food and Biological Engineering， Zhengzhou University of Light Industry， Zhengzhou 450002，China；

2. Institute of Hydrobiology， Chinese Academy of Sciences， Wuhan 430072， China；

3. Institute of Applied Mycology， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China）

Abstract：Cellophane-cover plating method was used to study the influences of radical scavengers on mycelial growth and sclerotial metamorphosis of Morchella crassipes. Five hydroxyl radical scavengers （mannitol， DMSO， sodium benzoate and N，N-dimethyl nitrosoaniline）， three mercapto compounds （L-cysteine， glutathione and β-mercaptoethanol） and ascorbic acid were tested. Results showed that the reactive oxygen radical scavengers could reduce fungal intracellular oxidative stress. The chemical agents tested inhibited the mycelial growth and sclerotia occurrence. The inhibition was enhanced with the increase of tested agents. Drugs with high concentrations inhibited completely the occurrence of sclerotia. With the enhancement of hydroxyl radical scavenging capacity， the concentration of scavengers completely inhibited occurrence of the sclerotia reduced accordingly. The effects on mycelial growth were similar. It is indicated that strong free radical scavengers such as sodium benzoate， N，N-dimethyl nitrosoaniline， mercapto compounds and ascorbic acid changed the color of colonies of M. crassipes， indicating the normal physiological activity was interrupted.

Key words： Morchella crassipes； radical scavenger； oxidative stress； mycelial growth； sclerotial metamorphosis

氧化應(yīng)激（Oxidative stress）是指細(xì)胞內(nèi)氧化增強(qiáng)劑與抗氧化劑之間的平衡向氧化增強(qiáng)的方向變化，高活性分子如活性氧（Reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生過多，超過了細(xì)胞的抗氧化能力，造成個(gè)體或細(xì)胞的氧化損傷[1]。在真菌中，氧化應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致DNA、蛋白質(zhì)和脂肪大分子氧化損傷，誘導(dǎo)細(xì)胞循環(huán)改變、細(xì)胞凋亡和分化的發(fā)生。氧化應(yīng)激會(huì)誘導(dǎo)齊整小核菌（Sclerotium rolfsii）等多種真菌菌核分化，通過形成菌核規(guī)避氧氣，阻止超氧化狀態(tài)的發(fā)展，避免對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生更大的損傷[2]。

羊肚菌（Morchella spp.）是一類世界性分布的名貴大型真菌，具有較大的食用和藥用價(jià)值。百余年來，國內(nèi)外對(duì)羊肚菌的分類鑒定、自然分布、生理生態(tài)、遺傳特性和人工栽培等進(jìn)行了大量研究。然而，羊肚菌的人工栽培至今仍未得到根本上的解決[3，4]。菌核是多種羊肚菌生活史的必經(jīng)階段，誘導(dǎo)形成菌核是其人工栽培的基礎(chǔ)[5-7]。關(guān)于羊肚菌菌核發(fā)生生理學(xué)的研究報(bào)道較少，沒有發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激影響羊肚菌菌核發(fā)生的系統(tǒng)研究報(bào)道。為此，采用平板覆蓋玻璃紙法，初步探討了甘露醇、二甲基亞砜（DMSO）、苯甲酸鈉和N，N-二甲基對(duì)亞硝基苯胺等4種羥基自由基清除劑，谷胱甘肽（還原型）、L-半胱氨酸和β-巰基乙醇等3種巰基化合物和維生素族抗氧化劑——抗壞血酸對(duì)粗柄羊肚菌（M.crassipes）菌絲生長和菌核發(fā)生的影響，以期為深入開展氧化應(yīng)激影響羊肚菌菌核發(fā)育的生理學(xué)機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試粗柄羊肚菌菌株組織分離自河南省鄭州市郊區(qū)發(fā)生的子囊果，經(jīng)過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)分析確定其分類地位[8]。

CYM完全培養(yǎng)基：蛋白胨2 g，酵母膏2 g，硫酸鎂0.5 g，磷酸二氫鉀0.46 g，磷酸氫二鉀1 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水定容至1 000 mL，121 ℃滅菌25 min。

1.2 試驗(yàn)方法

測定了甘露醇（0、0.05、0.10、0.20、0.40、0.80 mol/L）、DMSO（0、20、40、100、150、300 mmol/L）、苯甲酸鈉（0、2、6、10、15、20 mmol/L）、N，N-二甲基對(duì)亞硝基苯胺（0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 mmol/L）等4種羥基自由基清除劑，β-巰基乙醇（0、2、4、6、12、24 mmol/L）、L-半胱氨酸（0、1、5、10、20、40、80 mmol/L）和谷胱甘肽（還原型）（0、1、5、10、20、40、80 mmol/L）等3種巰基化合物以及抗壞血酸（0、30、60、90、120、150 mmol/L）對(duì)供試菌株菌絲生長和菌核發(fā)生的影響。所有化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純，采用0.22 μm的細(xì)菌過濾器過濾除菌。采用直徑9 cm的玻璃培養(yǎng)皿培養(yǎng)、試驗(yàn)。玻璃紙裁成圓形，直徑略小于9 cm，用10 mmol/L的EDTA-Na2水溶液煮沸 10 min，再用去離子水洗滌2次，121 ℃高壓蒸汽滅菌、備用。供試藥物過濾除菌后，待培養(yǎng)基冷卻至約50 ℃時(shí)，與培養(yǎng)基混勻、倒平皿，待培養(yǎng)基凝固后覆蓋玻璃紙。用打孔器打取直徑5 mm的菌絲塊接種于玻璃紙中間，24 ℃恒溫培養(yǎng)。接種塊菌絲的菌齡、厚度和大小保持一致。每天觀測并記錄菌落直徑（mm）和菌株生長發(fā)育狀態(tài)，按下式計(jì)算菌絲生長速度：菌絲生長速度（mm/h）=（菌落直徑-5）/（培養(yǎng)時(shí)間×2）。連續(xù)培養(yǎng)14 d，統(tǒng)計(jì)菌核數(shù)量，測量菌核大?。╩m）；揭下含有菌絲體和菌核的玻璃紙，用鑷子將菌核小心取出，50 ℃烘干至恒重，稱重（mg）；將剩余的菌絲刮下、烘干、稱重。每處理3次重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析與處理

采用SPSS 17.0軟件分析和處理數(shù)據(jù)。所有分析的數(shù)據(jù)為3個(gè)重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）。

2 結(jié)果與分析

2.1 羥基自由基清除劑對(duì)粗柄羊肚菌菌絲生長和菌核發(fā)生的影響

從圖1可以看出，甘露醇對(duì)粗柄羊肚菌菌絲生長的影響較小。低濃度（≤0.10 mol/L）時(shí)不影響菌絲生長，較高濃度則產(chǎn)生輕微的抑制作用。添加濃度達(dá)0.80 mol/L時(shí)，菌絲生長速度較對(duì)照組低10%左右。甘露醇整體上抑制菌核發(fā)育，其抑制效果隨著藥劑濃度的升高而增強(qiáng)，≥0.40 mol/L時(shí)完全抑制菌核的發(fā)生。此外，在給定的濃度條件下，甘露醇不影響粗柄羊肚菌菌落的色澤。

從圖2可以看出，DMSO對(duì)粗柄羊肚菌菌絲生長和菌核發(fā)生的影響強(qiáng)于甘露醇。低濃度（20 mmol/L）的DMSO，菌絲的生長速度和對(duì)照組相當(dāng)；隨著濃度的持續(xù)升高，菌絲生長速度平緩降低；最高濃度（300 mmol/L）條件下也沒有完全抑制菌絲體的生長。隨著DMSO濃度的增加，對(duì)菌核發(fā)生的抑制作用增強(qiáng)；濃度≥150 mmol/L時(shí)完全抑制菌核的發(fā)生。在測試的藥劑濃度下，沒有影響粗柄羊肚菌菌落的顏色。

從圖3可以看出，苯甲酸鈉對(duì)粗柄羊肚菌菌絲生長和菌核發(fā)生產(chǎn)生了較強(qiáng)的影響。隨著藥劑濃度的增加，對(duì)菌絲生長的抑制作用增強(qiáng)。15 mmol/L的條件下，24 ℃恒溫培養(yǎng)14 d，菌落未能長滿平板，菌落邊緣不整齊； 20 mmol/L時(shí)則完全抑制菌絲體的生長，表現(xiàn)為強(qiáng)抑制作用。濃度2 mmol/L苯甲酸鈉的平板有少量菌核的發(fā)生，菌核總重量為10.2 mg；濃度≥6 mmol/L以上時(shí)完全抑制菌核的發(fā)生。隨著苯甲酸鈉濃度的增加，菌落的顏色逐漸加深。15 mmol/L條件下，菌落顏色為深棕色。

從圖4可以看出，N，N-二甲基對(duì)亞硝基苯胺對(duì)粗柄羊肚菌菌絲生長和菌核發(fā)生的抑制作用最強(qiáng)。隨著藥劑濃度的升高，菌絲生長速度逐漸下降，菌核數(shù)量和總重量逐漸降低。1.5 mmol/L時(shí)完全抑制菌核的發(fā)生。菌落的顏色隨著藥劑濃度的升高逐漸變淺，濃度1.2 mmol/L下為淺棕色，濃度1.5 mmol/L下為黃白色。

2.2 巰基化合物對(duì)粗柄羊肚菌菌絲生長和菌核發(fā)生的影響

從圖5可以看出，谷胱甘肽（還原型）和L-半胱氨酸對(duì)粗柄羊肚菌菌絲生長和菌核發(fā)生產(chǎn)生了相似的影響。添加藥劑的濃度為1 mmol/L不影響菌絲的生長，但菌核發(fā)生比對(duì)照組顯著減少；藥劑濃度升高，對(duì)菌絲生長和菌核發(fā)生產(chǎn)生了顯著影響，濃度≥10 mmol/L時(shí)完全抑制菌核發(fā)生。通過藥物處理后的菌落形態(tài)和菌核發(fā)育狀況可以看出，谷胱甘肽（還原型）對(duì)菌絲生長的抑制作用強(qiáng)于L-半胱氨酸，濃度≥10 mmol/L時(shí)，24 ℃恒溫培養(yǎng)14 d，添加谷胱甘肽（還原型）菌絲難以長滿平板，菌落邊緣不整齊，菌落的顏色逐漸變淺，最終表現(xiàn)為白色菌落；而添加L-半胱氨酸，菌絲緩慢生長，最終可發(fā)滿平板，但菌絲生物量明顯降低，菌落顏色隨著藥劑濃度增高而逐漸變淺，最終為淺棕色至淡黃色。

從圖6可以看出，CYM平板中不同濃度的β-巰基乙醇表現(xiàn)出對(duì)粗柄羊肚菌菌絲生長和菌核發(fā)生產(chǎn)生較強(qiáng)的抑制作用。2 mmol/L時(shí)菌絲以較低的速度（0.02 mm/h）生長；持續(xù)培養(yǎng)14 d，菌絲可長滿平板，菌落淺棕色，氣生菌絲較少。4 mmol/L時(shí)強(qiáng)烈抑制菌絲生長，持續(xù)培養(yǎng)14 d菌絲未能長滿平板，菌落邊緣不整齊。濃度大于4 mmol/L則完全抑制菌絲生長。所有添加藥劑的平板均沒有菌核發(fā)生，表現(xiàn)為對(duì)菌核的強(qiáng)烈抑制作用。

2.3 抗壞血酸對(duì)粗柄羊肚菌菌絲生長和菌核發(fā)生的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著添加藥劑濃度的增加，抗壞血酸對(duì)粗柄羊肚菌菌絲生長的抑制作用增強(qiáng)。濃度為30 mmol/L時(shí)，菌絲生長速度（0.07 mm/h）明顯低于對(duì)照（0.33 mm/h）；濃度大于120 mmol/L時(shí)則完全抑制菌絲生長，表現(xiàn)出對(duì)菌絲生長的毒害作用。添加藥劑的平板菌落顏色為淺黃色至乳白色，邊緣不整齊。所有試驗(yàn)濃度下平板均沒有菌核發(fā)生。

3 小結(jié)與討論

按照反應(yīng)速率常數(shù)，測試的4種羥基自由基清除藥劑可分為3種類型：甘露醇為弱清除劑，DMSO和苯甲酸鈉為中等清除劑，N，N-二甲基對(duì)亞硝基苯胺為強(qiáng)清除劑。N，N-二甲基對(duì)亞硝基苯胺通過苯胺環(huán)的羥基化清除羥基自由基，清除速率較高；DMSO與羥基自由基反應(yīng)產(chǎn)生甲基自由基、烷類、甲烷磺酸、甲醛等多種產(chǎn)物；苯甲酸鹽通過其苯甲酸酯環(huán)的羥基化或脫羧作用清除羥基自由基；甘露醇為傳統(tǒng)的羥基自由基清除劑，通過形成羥基過氧化氫自由基發(fā)揮作用[9]。本研究表明，隨著測試藥劑的羥基自由基清除能力增強(qiáng)，完全抑制粗柄羊肚菌菌核發(fā)生的濃度相應(yīng)降低，菌絲生長也表現(xiàn)出類似的趨勢。羥基自由基清除劑對(duì)粗柄羊肚菌菌核發(fā)生的影響，與氧化應(yīng)激誘導(dǎo)真菌菌核發(fā)生的假說[2]相一致。該假說已經(jīng)在齊整小核菌、核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）、小核盤菌（S. minor）和立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）等產(chǎn)菌核的植物病原真菌上得到驗(yàn)證[10，11]。隨著藥劑自由基清除能力和濃度的增加，對(duì)自由基的清除程度加大，降低了胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平，抑制了菌核的發(fā)生。相比而言，DMSO完全抑制粗柄羊肚菌菌核發(fā)生及明顯抑制菌絲生長的添加濃度（分別為150 mmol/L和大于300 mmol/L）遠(yuǎn)高于自由基清除反應(yīng)速率常數(shù)相近的苯甲酸鈉（分別為6 和15 mmol/L），原因可能是DMSO較難通過真菌的細(xì)胞膜，被完全吸收發(fā)揮作用的能力更低。類似的結(jié)果也見于齊整小核菌等植物病原真菌研究[10，11]。

巰基氧化還原態(tài)（Thiol redox state，TRS）是很多主要的生物學(xué)過程，特別是氧化應(yīng)激的必需代謝效應(yīng)物[12]。還原態(tài)（游離巰基）和氧化態(tài)（形成二硫鍵）的TRS成分分別是氧化應(yīng)激低與高的指示劑。L-半胱氨酸含有游離巰基基團(tuán)，對(duì)維持多數(shù)抗氧化酶的活性具有重要作用。谷胱甘肽（還原型）是重要抗氧化酶谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）的底物。GPX利用谷胱甘肽催化過氧化氫生成水，或使有機(jī)氫過氧化物（ROOH）還原為ROH。β-巰基乙醇是潛在的還原分子、抗氧化劑和膜穩(wěn)定劑。這些巰基化合物均可直接或間接清除自由基，降低氧化應(yīng)激[9]。本研究表明，測試的3種巰基化合物對(duì)粗柄羊肚菌菌絲生長和菌核發(fā)生產(chǎn)生了較強(qiáng)的抑制作用，隨著添加濃度的增加，更顯著降低了氧化應(yīng)激，對(duì)菌核發(fā)生的抑制作用也加強(qiáng)。該結(jié)果與齊整小核菌等植物病原真菌的結(jié)果一致[13-15]，也符合氧化應(yīng)激誘導(dǎo)真菌菌核發(fā)生的假說[2]。

抗壞血酸是維生素族水溶性抗氧化劑，可清除多數(shù)ROS，如過氧化氫自由基、超氧化物自由基、羥基自由基和單態(tài)氧；還能充當(dāng)脂質(zhì)抗氧化劑及間接脂質(zhì)抗氧化劑，恢復(fù)維生素E的脂質(zhì)抗氧化劑性質(zhì)[9]。本研究表明，一定濃度的外源抗壞血酸對(duì)粗柄羊肚菌菌絲生長具有明顯抑制作用，對(duì)菌核發(fā)生的抑制作用更加顯著。該結(jié)果與立枯絲核菌、小核盤菌和齊整小核菌的研究結(jié)果一致[16-18]，也進(jìn)一步驗(yàn)證了氧化應(yīng)激誘導(dǎo)真菌菌核發(fā)生的假說。

試驗(yàn)結(jié)果表明，較大濃度的供試自由基清除劑對(duì)粗柄羊肚菌菌絲生長具有一定的抑制作用，且該抑制作用與藥劑濃度正相關(guān)，濃度過大完全抑制菌絲的生長。在齊整小核菌等植病真菌的研究中，也發(fā)現(xiàn)類似的結(jié)果[2，10-12]。通常情況下，抗氧化劑通過形成有毒的次級(jí)自由基產(chǎn)物和最終穩(wěn)定的副產(chǎn)物而清除自由基[9]。清除劑濃度越高，這些次級(jí)自由基的積累也越多，超過了真菌抗氧化機(jī)器的中和能力，因而掩蓋了清除劑的抗氧化作用，最終導(dǎo)致真菌死亡[10，11]。該結(jié)果可用于開發(fā)新型殺真菌劑，較高濃度的自由基清除劑可強(qiáng)烈抑制真菌菌絲生長，打破真菌的生活史。

CYM平板添加較強(qiáng)自由基清除劑（如苯甲酸鈉、N，N-二甲基對(duì)亞硝基苯胺、3種巰基化合物和抗壞血酸）會(huì)改變粗柄羊肚菌菌落的顏色。羊肚菌菌落顏色的改變是真菌正常生理活動(dòng)被打破的信號(hào)，是自由基清除劑保護(hù)性抗氧化應(yīng)答的表現(xiàn)（色素也具有抗氧化作用）。

與核盤菌等多種植病真菌不同，羊肚菌的菌核沒有明顯分化，因此可稱之為“假菌核”（Pseudosclerotium）。雖然為假菌核，但其發(fā)育過程與真菌核相似。菌核形成時(shí)，菌絲重復(fù)分枝，細(xì)胞膨大，細(xì)胞壁加厚，鄰近小菌核聚結(jié)和產(chǎn)生色素[3-6]。本研究表明，與核盤菌、齊整小核菌等多種植物病原真菌相似，氧化應(yīng)激也誘導(dǎo)粗柄羊肚菌菌核的發(fā)生，暗示羊肚菌菌核發(fā)育的生理學(xué)機(jī)制與其他真菌相似，可借鑒其研究成果。進(jìn)一步測定不同生理狀態(tài)菌株的TRS分子成分、凋亡或壞死相關(guān)的小片段DNA以及主要ROS成分、超氧化物自由基的變化，有助于深入理解羊肚菌菌核發(fā)育的生理學(xué)機(jī)制。采用比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)結(jié)合基因功能分析，深入研究羊肚菌菌核發(fā)育的分子機(jī)制，將會(huì)有效地促進(jìn)羊肚菌人工栽培馴化的發(fā)展。

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