常顯波+柳瑞翠+劉文正+張曉華

摘要：采用平板涂布法利用6種培養(yǎng)基從北極海洋沉積物中共分離出109株放線菌。選取34株代表菌株進行16S rDNA測序分析。結(jié)果表明，它們分屬于鏈霉菌屬（Streptomyces）、假諾卡氏菌屬（Pseudonocardia）和擬諾卡氏菌屬（Nocardiopsis），其中Streptomyces為優(yōu)勢菌屬；不同采樣點獲得放線菌的種類和數(shù)量有較大不同，站位點P37分離到的放線菌數(shù)量和種類最多；在109株放線菌中，有39株對病原菌有抑菌活性，其中有21株、11株和17株放線菌分別對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌生長有抑制作用。

關(guān)鍵詞：北極；海洋沉積物；放線菌；多樣性；抑菌活性

中圖分類號：Q939.99 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）13-3014-05

Diversity and Antibacterial Activity Screening of Actinomycetes in the Marine Sediments of North Pole

CHANG Xian-bo1，LIU Rui-cui1，LIU Wen-zheng2，ZHANG Xiao-Hua2

（1.College of Environmental & Material Engineering， Yantai University， Yantai 264005，Shangdong， China；

2. College of Marine Life Sciences， Ocean University of China， Qingdao 266003， Shangdong， China.）

Abstracts： Diversity and actinobacterial diversity in the sediments of North Pole was investigated by selective isolation method. 109 actinomycetes were isolated using six different culture media（M1-M6）. Bioinformatics analysis of the 16S rDNA sequences assigned the 34 representative isolates to three genera （Streptomyces， Pseudonocardia and Nocardiopsis）， and Streptomyces was the dominant genus. The type of culture medium exhibited significantly the number and diversity of actinomycetes recovered. Out of 109 isolates， 39 isolates exhibited antimicrobial activity against human pathogens. The proportion of actinomycetes with antibacterial activity was highest from the culture medium M5.

Key words： North Pole； sea sediments； actinomycetes； diversity； antimicrobial activities

自從Ekelof 1908年首次報道從南極分離出微生物后，各國的微生物學家相繼在極地進行過大量的研究工作，證明了微生物是極地生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，特別是在極地的海水、海冰、海底沉積物中存在著各種類型的微生物[1]。由于極地所處的地理位置比較特殊，從而形成了一個寒冷、干燥、強輻射的環(huán)境條件，生存于其中的微生物必須具備相應(yīng)獨特的分子生物學機制和生理生化特征去適應(yīng)這樣的極端環(huán)境，特別是對于能夠產(chǎn)生多種次級代謝產(chǎn)物的放線菌來說，極地應(yīng)該是產(chǎn)生新型生物活性物質(zhì)的放線菌菌株的重要生存繁衍之地[2，3]。對極地海洋沉積物中的放線菌進行分離培養(yǎng)、鑒定、抗菌活性等方面的研究，有利于進一步了解、開發(fā)和利用該地區(qū)放線菌資源。

為此，對來自北極的10份海洋沉積物樣品進行放線菌的分離培養(yǎng)，通過16S rDNA序列測定，對分離出的菌株進行分子鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析，再對放線菌株進行抗菌活性篩選，希望能為今后極地海洋放線菌資源的研究和開發(fā)利用提供有價值的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和儀器 PCR 引物、PCR 常規(guī)操作用試劑和酶均購自TaKaRa公司。高壓滅菌鍋為上海產(chǎn)LS-B50L、高速冷凍離心機為Eppendorf 公司5817R型、PCR儀為Eppendorf AG 22331 Hamburg；凝膠成像系統(tǒng)GK-330C購自美國伯樂公司。

1.1.2 樣品 10份極地海洋沉積物樣品來自中國第三次北極科學考察，由中國極地研究中心提供，采樣點概況見表1。

1.1.3 培養(yǎng)基 ①分離培養(yǎng)基：培養(yǎng)基M1（可溶性淀粉10 g，干酪素 0.3 g，KNO3 2 g，K2HPO4 2 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，瓊脂 20 g，陳海水1 L，pH 7.2～7.4）、培養(yǎng)基M2（酵母浸出粉 4 g，麥芽浸出粉 10 g，葡萄糖 4 g，瓊脂 20 g，陳海水1 L，pH 7.2～7.4）、培養(yǎng)基M3（葡萄糖 10 g，天門冬氨酸 0.5 g，K2HPO4 0.5 g ，MgSO4·7H2O 0.05 g，瓊脂 20 g，陳海水1L，pH 7.2～7.4）、培養(yǎng)基M4（棉子糖 10 g，L-組氨酸 1 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，瓊脂 20 g，陳海水1 L，pH 7.2～7.4 ）、培養(yǎng)基M5（天門冬氨酸 0.1 g，蛋白胨2 g，丙酸鈉4 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，瓊脂 20 g，陳海水1 L，pH 7.2～7.4）和培養(yǎng)基M6（甘油 6 mL，精氨酸 1 g，K2HPO4 1 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，瓊脂 20 g，陳海水1 L，pH 7.2～7.4）。所有分離培養(yǎng)基中均添加終濃度為25 μg/mL的萘啶酸以抑制快速生長的細菌，尤其是革蘭氏陰性細菌；同時添加終濃度為100 μg/mL的制霉菌素溶液以抑制真菌的生長。②抑菌活性試驗培養(yǎng)基：培養(yǎng)基M2和LB培養(yǎng)基（酵母膏5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，瓊脂20 g，去離子水1 000 mL，pH 7.0）。

1.1.4 病原菌菌株 以金黃色葡萄珠菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和遲緩愛德華氏菌（Edwardsiella tarda）為指示菌，菌株由中國海洋大學海洋生命學院海洋微生物實驗室提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株分離方法 采用傳統(tǒng)的平板涂布法對樣品進行分離，在28 ℃培養(yǎng)7～15 d。根據(jù)菌落大小、形態(tài)、顏色進行初步分離篩選并純化，將純化后的菌株接種到M2斜面上，培養(yǎng)3～4 d后，以5 mL滅菌保種液（0.85%NaCl溶液+15%甘油）洗下菌苔，制成菌懸液，每個菌種保存3管，-80 ℃保存。

1.2.2 菌株的抑菌活性檢測方法 采用牛津杯法檢測。

1）用竹簽將供試放線菌株接種到M2液體培養(yǎng)基試管中，于28 ℃搖床以150 r/min培養(yǎng)2～3 d；菌液于12 000 r/min下離心10 min，取上清液進行試驗。

2）將金黃色葡萄珠菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和遲緩愛德華氏菌接種于LB培養(yǎng)基，遲緩愛德華氏菌置于28 ℃、150 r/min的搖床中振蕩培養(yǎng)，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌則置于37 ℃、150 r/min的搖床中振蕩培養(yǎng)8～10 h后即可。

3）取各種病原菌100 μL分別涂布于各自的培養(yǎng)基平板上，再在平板上等距離放置6～8個無菌的牛津杯，吸取120 μL發(fā)酵上清液加入牛津杯中。移至37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h后，觀察牛津杯周圍是否形成抑菌圈。

1.3 系統(tǒng)發(fā)育特征分析

16S rDNA PCR擴增和系統(tǒng)進化分析：參照文獻[4]的方法提取放線菌基因組DNA，應(yīng)用細菌16S rDNA通用引物（正向引物：8-27 F，反向引物：1429-1445R）進行PCR 擴增。測序所得結(jié)果用Blast軟件在GenBank/EMBL/DDBJ 等數(shù)據(jù)庫中進行相似性搜索，選取同源性比較高的典型菌株的16S rDNA 序列作為參比對象，用Clustal-X[5]軟件進行多重序列比對，利用MEGA-4[6]軟件，采用鄰接法（Neighbor-Joining Method）進行聚類分析和系統(tǒng)進化樹構(gòu)建。

2 結(jié)果與分析

2.1 放線菌菌株的分離

從10份極地樣品中共分離出109株放線菌，菌株編號為CXB503、CXB513、CXB516、CXB521～CXB523、CXB525～CXB531、CXB533、CXB535～CXB552、CXB554～CXB575、CXB579～CXB589、CXB592～CXB601、CXB603～CXB635、CXB636、CXB639、CXB640。從圖1可知，各個站位點放線菌分離情況有較大差別。從采樣點P37分離到的放線菌菌株無論是在數(shù)量還是種類上都是最多的，共分離到3個屬的43株放線菌，放線菌分離率為39.4%，其次是站位點B12、S14、B-85-B和S24，而從P23樣品中分離到放線菌的數(shù)量和種類最少，只分離到1個屬的2株放線菌，放線菌分離率只有1.8%。

2.2 放線菌的16S rDNA序列分析

根據(jù)放線菌的特殊形態(tài)特征和顏色差異，選取34株代表菌株提取DNA及進行16S rDNA的擴增，并進行測序分析，將測序結(jié)果提交到GenBank數(shù)據(jù)庫，獲得序列號（JF512540～JF512561）。由圖2可知，從北極沉積物樣品中共分離出3個屬的放線菌：Streptomyces（31株）、Pseudonocardia（1株）和Nocardiopsis（2株），其中優(yōu)勢菌屬為Streptomyces；北極海區(qū)沉積物中可培養(yǎng)Streptomyces各類群多樣性較高，在Streptomyces內(nèi)不同種之間形成分支，其中與Streptomyces violascens同源性較高的菌株有10株，與已知菌種序列相似度在99.4%～100%，Streptomyces violascens為Streptomyces中的優(yōu)勢類群；與Streptomyces hydrogenans和Streptomyces somaliensis同源性較高的菌株分別有6株和5株，與已知菌種序列相似度均在99.6%以上；與Streptomyces hiroshimensis、Streptomyces rubiginosohelvolus和Streptomyces griseoplanus同源性較高的菌株各有2株，與已知菌種序列相似度在99.8%～100%；另外有2株菌分別屬于Streptomyces rutgersensis和Streptomyces albidoflavus，與已知菌種序列相似度均在99.9%以上。各站位點放線菌多樣性存在差異，Streptomyces在各站位點均有分布；2株Nocardiopsis菌株分離自站位點B12和P37，1株P(guān)seudonocardia菌株分離站位點S14。

2.3 抑菌活性篩選結(jié)果

抑菌試驗結(jié)果（表2）表明，在109株放線菌中，有39株對病原菌表現(xiàn)出抑菌活性，具有抑菌活性的菌株比例為35.8%；對革蘭氏陽性病原菌具有較好的抑制效果，對革蘭氏陰性病原菌的活性較弱；其中21株菌能抑制枯草芽孢桿菌生長、11株菌能抑制大腸桿菌生長、17株菌能抑制金黃色葡萄球菌生長、沒有菌株能抑制遲緩愛德華氏菌生長；能同時抑制3種病原菌生長的放線菌有4株，分別為CXB526、CXB623、CXB626和CXB627；菌株CXB632對大腸桿菌的抑菌圈直徑高達24 mm，但對其他病原指示菌無活性。不同站位點海洋沉積物中具有生物活性潛力的放線菌比例不同，站位點B85-B、B12和R15獲得具有抑菌活性的放線菌比例較高，均≥50%，其中站位點B85-B分離到的11株放線菌都具有抑菌活性；其余站位點分離到具有抑菌活性的放線菌比例較低，其中站位點No.1和P23沒有分離出具有抑菌活性的放線菌。

3 討論

從北極海區(qū)不同采樣點中分離到的放線菌種類和數(shù)量有較大差異，站位點P37分離到的放線菌種類和數(shù)量最多，與其他9個采樣點相比較，樣品采樣深度和質(zhì)地是最主要的區(qū)別，有意思的是，站位點No.1和P37質(zhì)地均為粉沙黏土，但采樣深度不同，分離效果卻有較大差異。Bredholdt等[7]曾對北極Trondheim海灣不同深度的沉積泥樣進行放線菌分離，發(fā)現(xiàn)在同一區(qū)域相同深度不同采樣點的兩份樣品放線菌分離情況有很大差異，分析原因為兩份樣品的土質(zhì)不同，一份為泥樣，一份含有細沙。滕海波等[8]對8份不同海區(qū)海洋沉積樣品進行放線菌分離，發(fā)現(xiàn)來自南極中山站地區(qū)潮間帶樣品ZS3中分離到的放線菌種類和數(shù)量最多，而從北極新奧爾松地區(qū)采集的沉積樣品KS6中分離到的放線菌最少?？梢?，不同采樣點樣品間的放線菌多樣性和數(shù)量都會有很大不同，這與樣品所處的深度、溫度、營養(yǎng)、鹽度、樣品質(zhì)地等各因素有關(guān)。

不同海域放線菌的種群組成各不相同，研究發(fā)現(xiàn)大部分放線菌種類表現(xiàn)出地域差異性。Solano等[9]從北太平洋和哥斯達黎加的加勒比海岸沉積物中分離培養(yǎng)了137株放線菌，分別屬于15個科21個屬，其中Streptomyces是主要菌屬。Pathom-Aree等[10]對馬里亞納海溝中的深海（10 898 m）沉積物的放線菌多樣性進行研究，研究中發(fā)現(xiàn)了38株海洋放線菌，分別屬于6個屬（Dermacoccus、Kocuria、Micromonospora、Streptomyces、Tsukamurella和Williamsia），另外還首次在海洋環(huán)境中發(fā)現(xiàn)了原來只在陸生環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的Dermacoccus和Tsukamurella的菌種。此次試驗從北極海區(qū)沉積物中分離到3個菌屬（Streptomyces、Pseudonocardia和Nocardiopsis）的放線菌，其中優(yōu)勢菌屬為Streptomyces，這與其他研究者的研究結(jié)果有很大不同，如Yu等[11]在對北極加拿大海盆沉積物放線菌的分離研究中，未分離到Streptomyces的菌株，分離菌株主要為紅球菌屬（Rhodococcus）、迪茨氏菌屬（Dietzia）、兩面神菌屬（Janibacter）、腫大地桿菌屬（Terrabacter）、玫瑰考克氏菌屬（Kocuria）和節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）；滕海波[8]對兩極地區(qū)海洋沉積物進行放線菌的分離培養(yǎng)，其中優(yōu)勢菌群為賴氏菌屬（Leifsonia）和紅球菌屬（Rhodococcus），也未分離到Streptomyces屬。造成這種差異的原因是多方面的，經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)溫度可能是造成這種差異的主要原因，Yu等[11]和滕海波[8]分別在15 ℃和12 ℃下培養(yǎng)樣品，而本研究是在28 C培養(yǎng)樣品，低溫培養(yǎng)可能抑制氣生菌絲發(fā)達的放線菌生長，所以在樣品中沒有分離到Streptomyces，具體機制有待進一步研究。

一些研究者已經(jīng)報道了從海洋環(huán)境中分離的放線菌對多種病原菌具有抗菌活性，如Bredholdt等[7]從挪威最大的峽灣——特隆赫姆峽灣的海底沉積物中分離出3 200株放線菌，并對所分離出的放線菌進行抗細菌和抗真菌的篩選，顯示這些放線菌具有強大的抗生素生產(chǎn)潛力；Ramesh等[12]從孟加拉灣分離的208株放線菌，有111株有抑菌活性；Imada等[13]從大土灣分離的100株放線菌中，有59株有抑菌活性。在本研究中，不同站位點海洋沉積物中具有生物活性潛力的放線菌比例不同，站位點B85-B、B12和R15獲得具有抑菌活性的放線菌比例較高，這也充分說明海洋沉積物中放線菌次生代謝產(chǎn)物的合成在一定程度上受其生長環(huán)境的影響和限制，沉積物的經(jīng)緯度、深度、物質(zhì)組成、稠度與其中生長的微生物的生理代謝途徑密切相關(guān)。極地沉積物樣品中有抑菌活性的放線菌都屬于Streptomyces，進一步印證了Streptomyces仍然是海洋放線菌次生代謝產(chǎn)物的主要產(chǎn)生菌。本研究抗菌活性試驗所選的4種指示菌均為致病菌，分離到的放線菌對其中3種致病菌表現(xiàn)出較好的抑菌活性，從抑菌譜以及活性強弱上看，菌株CXB623、CXB627和CXB632有進一步研究的價值，對以后尋找新的抗生素提供了資源。

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