歐陽永長　梁梓添　姚雅琪　馮穎　王鵬飛

摘要：利用3種培養(yǎng)基對兩種南海海綿Axinyssa和Halichondria共附生的放線菌（Actinobacterial）進行分離和培養(yǎng)，共得到41個放線菌菌株，分別屬于Brachybacterium、Janibacter、Dermacoccus、Brevibacterium、Saccharomonospora、Arthrobacter、Micromonospora、Tsukamurella和Streptomyces 9個屬的14個種，其中Y12和Y13為候選新種屬。這些放線菌能抑制金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的生長，其分子方法顯示這些放線菌具有產(chǎn)生聚酮類化合物和非核糖體多肽的潛力。

關鍵詞：海綿；微生物多樣性；放線菌（Actinobacterial）

中圖分類號：Q93 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）13-3002-04

Isolating Actinobacteria from Two Marine Sponges of the South China Sea

OUYANG Yong-chang，LIANG Zi-tian，YAO Ya-qi，F(xiàn)ENG Ying，WANG Peng-fei

（Department of Biotechnology，Guangzhou Medical College，Guangzhou 510182， China ）

Abstract： 41 strains of actinomycetes were isolated from two marine sponges collected from the South China Sea by 3 culture medium. Based on sequencing 16S rRNA genes， these isolates were divided into 9 groups initially identified as genera Brachybacterium， Janibacter， Dermacoccus， Brevibacterium， Saccharomonospora， Arthrobacter， Micromonospora， Tsukamurella and Streptomyces by phylogenetic analysis. Among them， Y12 and Y13 may be new genera. All isolates could restrain the growth of Staphylococcusaureus，Bacillus subtilis and Escherichia coli， and had potential to produce polypeptide and nonribosomal peptide.

Key words： marine sponge； diversity of bacteria； actiobacteria

隨著多抗性病原菌的流行，開發(fā)新抗生素的需求越來越迫切。放線菌（Actinobacterial）富產(chǎn)的次生代謝產(chǎn)物是抗生素開發(fā)的重要資源。目前，超過100個應用于農(nóng)業(yè)和人類疾病治療的抗生素來源于放線菌[1]。但隨著研究的深入從放線菌中發(fā)現(xiàn)新次生代謝產(chǎn)物越來越難，主要原因之一是缺乏新放線菌資源。為尋找新的放線菌，21世紀以來研究者開始將目光投向獨特的海洋環(huán)境，迄今已從海洋樣品中培養(yǎng)出海洋專屬的放線菌，如Salinispora等，并從其中發(fā)現(xiàn)了新穎的化合物Salinosporamide A[2]。

海綿屬多孔動物門，與其共附生的微生物豐富，富含活性產(chǎn)物。目前從海綿中分離得到的活性代謝產(chǎn)物占已發(fā)現(xiàn)海洋天然產(chǎn)物的40%，海綿已成為最大的新藥候選分子來源[3]。從海綿中得到的大部分活性產(chǎn)物來源于與其共附生的微生物。Zhang等[4]和Jiang等[5]的研究表明海綿富含新放線菌資源，但只有很少一部分微生物能在實驗室培養(yǎng)，剩余絕大部分是未培養(yǎng)的微生物資源。本試驗對中國南海兩種海綿中可培養(yǎng)的放線菌進行研究，獲得了多樣性豐富的放線菌，其中包括多株候選新種，分子試驗和抑菌活性篩選表明，這些放線菌富產(chǎn)聚酮和非核苷酸多肽等活性產(chǎn)物。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

兩種海綿采自中國南海三亞海區(qū)（18.3°N，109.5°E），經(jīng)鑒定分別屬于Axinyssa和 Halichondria兩個屬。海綿樣品經(jīng)低溫保存后于實驗室處理。

1.2 放線菌的分離與培養(yǎng)

取海綿5 g，用無菌水沖凈表面泥沙后置于培養(yǎng)皿中，再用無菌水漂洗6次，最后將其置于研缽中， 加5 mL無菌生理鹽水制成勻漿液。將勻漿液10倍梯度稀釋后，取10-3、10-4、10-5稀釋液200 μL分別均勻涂抹于M1、M2和M3 3種培養(yǎng)基上（含K2Cr2O7，50 μg/mL）。M1：海綿榨汁100 mL，胰蛋白胨4 g， 酵母提取物5 g，瓊脂糖15 g，天然海水500 mL和去離子水 400 mL；M2：可溶性淀粉10 g，KNO3 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.25 g， K2HPO4 0.25 g，CaCO3 0.01 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，瓊脂糖20 g，去離子水1 000 mL；M3：100%甘油6 mL，精氨酸1 g，K2HPO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，瓊脂糖20 g，去離子水1 000 mL。將培養(yǎng)基置于28 ℃環(huán)境下培養(yǎng)2～4周。根據(jù)菌體形態(tài)、顏色等條件挑取不同種類菌落進行分離培養(yǎng)，并提取DNA。DNA提取方法參照文獻[6]進行。利用16S rDNA基因對分離所得菌株進行初步鑒定。擴增16S rDNA基因的引物為27F：5′-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1500 r：5′-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3′，PCR體系參照Jiang等[5]的方法配制。PCR產(chǎn)物直接測序（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司），所得序列與GenBank數(shù)據(jù)庫進行比對，初步確定目的菌落的種屬。

1.3 放線菌活性產(chǎn)物的初步評估

利用PCR方法檢測放線菌是否擁有聚酮類（PKS）Ⅰ型、Ⅱ型和非核糖體合成多肽（NRPS）等化合物的合成基因。引物序列、PCR方法和過程參照Jiang等[5]的方法進行。利用平板法對放線菌進行抗菌活性測定。指示菌株主要包括兩個革蘭氏陽性菌株，分別為枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和一個革蘭氏陰性菌株大腸桿菌（Escherichia coli）。抑菌圈在1 mm以上時認為放線菌有抑制指示菌活性的作用。

1.4 方格星蟲共附生菌的多樣性分析

所有測序結果經(jīng)嵌合體檢測后提交GenBank數(shù)據(jù)庫，并與其他序列進行比對，利用MEGA5.0軟件中的Neighbor-Joining法構建系統(tǒng)進化樹[7]。

2 結果與分析

2.1 放線菌的初步鑒定

從M1、M2和M3 3種培養(yǎng)基中共分離得到41個菌株。利用PCR 擴增出16S rDNA 基因，測序后與GenBank 中的核酸序列比對。16S rDNA基因分析表明，41個菌株分別屬于Brachybacterium、 Janibacter、 Dermacoccus、 Brevibacterium、 Sacchaomon

ospora、Arthrobacter、Micromonospora、Tsukamurella和Streptomyces等 9個屬的14個種（表1）。其中Y12和Y13 與已知菌的相似性低（分別為96.3%和94.9%），可能屬于新菌屬。

2.2 放線菌活性產(chǎn)物的初步評估

利用PKS和NRPS合成酶的基因片段對放線菌生產(chǎn)這兩類物質的潛力進行分析，結果見表1。多數(shù)放線菌含有PKS或NPRS基因，其中B10、2d24和A16同時含有PKS Ⅰ、Ⅱ和NRPS合成基因。抗菌活性篩選試驗同樣顯示多數(shù)放線菌（除B3和Y4外）能產(chǎn)生抑制金黃色葡萄球菌生長的活性物質，其中Y12和Y13放線菌對革蘭氏陰性菌有明顯的抑制作用。這表明分離所得的放線菌能夠產(chǎn)生多種活性物質，并具有產(chǎn)生聚酮類和非核苷酸多肽的潛力。

2.3 序列提交和多樣性分析

16S rDNA基因測序的結果經(jīng)比對后選擇代表性序列提交GenBank，序列號為KF746912-KF746915。利用MEGA 5.0軟件對這些序列進行分析，采用鄰接法，重復取樣1 000次，構建的系統(tǒng)進化樹如圖1所示。

3 小結與討論

海綿是過濾性捕食的多細胞無脊椎動物，其獨特的捕食方式使其體內及體表共附生了大量的微生物，其中包括豐富的放線菌資源[8，12，13]。Webster等[8]利用原位雜交等手段證明了海綿Rhopaloeides odorabile中存在大量未培養(yǎng)的放線菌群落。為從海綿中獲得新的抗生素資源，包括中國學者在內的多個研究團隊對海綿Iotrochota sp.[5]、Hymeniacidon perleve[8]和Haliclona sp.[9]中的放線菌進行研究，從中分離得到了豐富的放線菌資源，其中還包括新的放線菌菌群，并且發(fā)現(xiàn)不同海綿有著特異的放線菌菌群。早前筆者對來自汕頭海域的Haliclona sp.放線菌進行研究，從中分離得到Streptomycetaceae、Nocardiopsis和Micromonospora等10種放線菌。本試驗中，筆者從來自三亞海域的Axinyssa和Halichondria兩種海綿中分離得到41個放線菌菌株，分別屬于Brachybacterium、Janibacter、Dermacoccus、 Brevibacterium、 Saccharomonospora、 Arthrobacter、Micromonospora、Tsukamurella和Streptomyces 9個屬的14個種。其中Y23和Y12的16S rDNA基因序列與已培養(yǎng)的放線菌相似性低，表明其可能是新的放線菌屬。從海綿Axinyssa中分離得到的放線菌菌落明顯多于海綿Halichondria，且候選新菌和稀有放線菌絕大部分來自于前者。盡管分子生物學方法表明不同的海綿中都存在大量未培養(yǎng)的放線菌，但試驗結果顯示選擇合適的海綿種類是獲得新稀有放線菌的重要因素。

聚酮類化合物和非核糖體多肽是具有廣泛生物活性的次生代謝產(chǎn)物[10]。尤其是聚酮類化合物，已知的聚酮化合物超過10 000個，如臨床上應用的紅霉素、四環(huán)素、利福平、兩性霉素、阿霉素、洛伐他丁、FK506、雷帕霉素以及農(nóng)牧業(yè)用阿弗菌素和莫能星、泰樂菌素等都屬于這類化合物[10，11]。聚酮化合物由聚酮合成酶催化小分子羧酸經(jīng)過縮合而成，通過分子方法對聚酮合成酶基因保守區(qū)域的檢測可以評估放線菌產(chǎn)聚酮化合物的能力。為評價本試驗中分離所得的放線菌活性產(chǎn)物的多樣性，對放線菌的聚酮類化合物（PKSI、PKSII）和非核糖體合成多肽（NRPS）合成基因進行檢測。同其他資源分離得到的放線菌一樣[4，5，15，16]，本試驗中放線菌絕大部分都含有聚酮化合物和非核糖體合成基因，具有產(chǎn)生這些化合物的潛力。同時抑菌試驗表明這些放線菌大部分都能產(chǎn)生活性產(chǎn)物抑制革蘭氏陽性菌，如金黃色葡萄球菌等的生長，其中小部分放線菌的活性產(chǎn)物還能同時抑制革蘭氏陰性菌，如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌的生長。特別是菌株Y12和Y13，不僅具有合成PKS和NRPS的潛力，同時能產(chǎn)生抑菌活性產(chǎn)物，并且作為候選新菌具有更多機會獲得新的次生代謝產(chǎn)物，這些放線菌的獲得為新抗生素的開發(fā)積累了資源。

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