， ，2， ，，

(1.浙江工業(yè)大學(xué) 化學(xué)工程與材料學(xué)院，浙江 杭州 310032;2.浙江省化工研究院，浙江 杭州 310023)

水楊酸(鄰羥基苯甲酸)是醫(yī)藥、香料、染料、橡膠助劑、光穩(wěn)定劑[1]等精細(xì)化學(xué)品的重要原料，同時(shí)也是植物體內(nèi)普遍存在的一種植物激素，被廣泛應(yīng)用于外源脅迫和刺激等逆境生理的研究[2].阿司匹林(乙酰水楊酸)是水楊酸類非甾體抗炎藥，是常用的解熱、消炎鎮(zhèn)痛藥.在臨床上有治療風(fēng)濕痛，抑制血小板集聚[3]的功效.大量食用會(huì)引起嘔吐、腹痛、頻促、酸中毒等癥狀，嚴(yán)重地影響了人們的身體健康[4].因此，研究測(cè)定阿司匹林藥物中水楊酸的含量具有實(shí)際意義.近年來(lái)報(bào)道水楊酸的測(cè)定方法主要有：分光光度法[5-6]、氣質(zhì)聯(lián)用法[7]、高效液相色譜法[8-13]、液質(zhì)聯(lián)用法[14]、離子色譜法[15-16]等.

對(duì)于藥物這種成分復(fù)雜的樣品，高效液相色譜法經(jīng)常出現(xiàn)干擾，需要利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行測(cè)定.對(duì)于氣相色譜來(lái)說(shuō)，一般選用弱極性或中等極性色譜柱.由于水楊酸屬于極性較強(qiáng)的化合物.因此，需要進(jìn)行衍生化處理[17-18]，其中，使用四丁基硫酸氫銨作為衍生試劑較為普遍.Kruegert等[19]采用GC-FID測(cè)定液體洗滌劑和污水中的鏈狀苯磺酸鹽(LAS)，經(jīng)C18固相萃取柱凈化后用0.005 mol/L四丁基硫酸氫銨將LAS衍生成其丁基酯.Liu等[20]采用分散液液微萃取(DLLME)離子對(duì)在線衍生聯(lián)用GC-MS/MS測(cè)定水樣中的全氟羧酸(PFCAs)，采用四丁基硫酸氫銨在GC進(jìn)樣口中將PFCAs衍生為其丁基酯，在負(fù)化學(xué)電離源下進(jìn)行MS/MS分析.Xu等[21]采用離子對(duì)液液萃取結(jié)合進(jìn)樣口衍生GC-MS測(cè)定非甾體類抗炎藥(NSAIDs)，用四丁基硫酸氫銨將待測(cè)物轉(zhuǎn)變成其羧酸酯離子絡(luò)合物，并用乙酸乙酯超聲輔助萃取離子對(duì)衍生物.直接進(jìn)樣桿技術(shù)(Direct sample introduction，DSI)是1997年以色列學(xué)者Amirav等[22]首次報(bào)道的一種新型的氣相色譜進(jìn)樣技術(shù)，此技術(shù)將樣品前處理減至最少，甚至無(wú)需樣品凈化即可獲得準(zhǔn)確的定性和定量結(jié)果，適合于分析復(fù)雜基質(zhì)樣品.同時(shí)采用進(jìn)樣口在線衍生[23-28]可提高檢測(cè)靈敏度.本實(shí)驗(yàn)提出了一種新的丁基酯衍生化前處理方法，通過引進(jìn)離子對(duì)試劑四丁基硫酸氫銨(TBAHS)，在氣相色譜進(jìn)樣口高溫下得到衍生產(chǎn)物水楊酸丁酯，用來(lái)測(cè)定阿司匹林泡騰片中的游離水楊酸.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用儀(CP3800-Saturn2000)，配有1079進(jìn)樣口和直接進(jìn)樣桿(ChromatoProbe)裝置(圖1)，美國(guó)Varian公司制造；KQ-50E型超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司；分析天平，規(guī)格Max210g，d=0.1 mg，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；磁力攪拌器，美國(guó)Corning公司；TGL-16C離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；甲醇，分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；乙腈，特級(jí)色譜純，天津四友精細(xì)化學(xué)品有限公司；無(wú)水硫酸鈉，分析純，上海試四赫維化工有限公司；冰醋酸，分析純，杭州化學(xué)試劑廠；水楊酸，分析純，上?；瘜W(xué)試劑采購(gòu)供應(yīng)五聯(lián)化工廠；離子對(duì)試劑：四丁基硫酸氫銨(TBAHS)(純度為99.9%)，四丁基溴化銨(TBABr)(純度為99.9%)，四丁基碘化銨(TBAI)(純度為99.9%)，美國(guó)Supelco公司；阿司匹林泡騰片，購(gòu)自杭州九洲大藥房.

圖1 GC-MS分析中直接進(jìn)樣桿裝置示意圖

1.2 實(shí)驗(yàn)條件

1.2.1 色譜條件

色譜柱：J&W DB-5MS石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣為高純氦氣(99.999%)，流速為0.8 mL/min；1079進(jìn)樣口升溫程序：起始溫度90 ℃，保持1 min(分流比50:1)，以200 ℃/min快速升溫至280 ℃，保持2 min(不分流)，之后進(jìn)樣口自動(dòng)降溫(分流比20∶1).柱溫箱升溫程序：起始柱溫40 ℃，保持5 min，再以20 ℃/min升溫至280 ℃，保持1 min(圖2).

圖2 分析過程中使用的升溫程序

1.2.2 質(zhì)譜條件

電離源為電子轟擊(EI)；EI電離能量為70 eV.離子阱溫度為150 ℃，歧管溫度為40 ℃，GC-MS傳輸線溫度為280 ℃，質(zhì)量掃描范圍為45～200m/z，掃描速度為3 scans/s，燈絲電流10 μA，電子倍增器電壓2 000 V.

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

準(zhǔn)確稱取一定量經(jīng)粉碎后的待測(cè)樣品粉末于40 mL頂空瓶中，加入10 mL含1%冰醋酸的乙腈溶劑，超聲萃取10 min，加入200 μL濃度為0.5 mol/L的四丁基硫酸氫銨(TBAHS)離子對(duì)衍生試劑，放入磁子攪拌10 min，加入適量無(wú)水Na2SO4，混合均勻，靜置，取2 μL至直接進(jìn)樣桿專用的微量樣品瓶中進(jìn)GC-MS分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 水楊酸與離子對(duì)試劑的衍生機(jī)理

水楊酸屬于極性較強(qiáng)的酸性化合物，無(wú)論在非極性還是中等極性色譜柱上，其保留能力都很弱，色譜峰脫尾嚴(yán)重，響應(yīng)較小，因此常規(guī)條件下難以進(jìn)行分離測(cè)定.為了更好的對(duì)水楊酸進(jìn)行測(cè)定，所以選用離子對(duì)試劑四丁基硫酸氫銨(TBAHS)與其反應(yīng)，將其轉(zhuǎn)化成易揮發(fā)的水楊酸丁酯，反應(yīng)式為

常溫下，水楊酸與離子對(duì)試劑四丁基硫酸氫銨(TBAHS)反應(yīng)生成絡(luò)合物，且離子對(duì)試劑大大過量(摩爾比約1∶100).水楊酸與TBAHS反應(yīng)生成的絡(luò)合物在氣相色譜進(jìn)樣口的高溫作用下受熱分解，生成易揮發(fā)的水楊酸丁酯，反應(yīng)式為

因此，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀就可以進(jìn)行水楊酸的定性和定量分析檢測(cè).

2.2 衍生產(chǎn)物的定性分析

經(jīng)過離子對(duì)衍生處理后，水楊酸會(huì)衍生成為水楊酸丁酯，由于水楊酸衍生后極性減弱，沸點(diǎn)降低，信號(hào)響應(yīng)較高.按照實(shí)驗(yàn)步驟，以水楊酸標(biāo)準(zhǔn)溶液與離子對(duì)試劑TBAHS形成的離子對(duì)絡(luò)合物，在氣相色譜進(jìn)樣口受熱生成的水楊酸丁酯，在離子阱質(zhì)譜EI全掃描條件下得出的總離子流圖(TIC)如圖3所示.

出峰時(shí)間為13.15 min所對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜圖如圖4所示.

圖3 水楊酸丁酯總離子流圖

圖4 水楊酸丁酯的質(zhì)譜圖

根據(jù)氣相色譜程序升溫條件和水楊酸丁酯的物理性質(zhì)，在質(zhì)譜全掃描模式下，由質(zhì)譜碎片圖(圖4)可知：該化合物的主要的質(zhì)譜碎片峰如下：m/z=194為水楊酸丁酯的分子離子峰；m/z=138[M-C4H9]碎片，為分子失去丁基后的離子碎片；m/z=120[M-C4H9-H2O]碎片，為失去羧基上的羥基連帶一個(gè)氫質(zhì)子后的碎片；m/z=92[M-C4H9-COOH]碎片，為在失去羧基上的羥基后再失去羰基后的碎片.結(jié)合NIST庫(kù)中水楊酸丁酯的質(zhì)譜圖，以及水楊酸丁酯碎片的裂解方式，可以確定13.15 min峰處的化合物為水楊酸丁酯.

2.3 進(jìn)樣口分解溫度的選擇

進(jìn)樣口分解溫度是影響衍生化效率的重要因素之一，分解溫度對(duì)絡(luò)合物分解反應(yīng)的影響至關(guān)重要,溫度過低，分解反應(yīng)不完全.選擇在200，250，280，290，300 ℃五個(gè)溫度下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(圖5).結(jié)果表明：在280 ℃時(shí)衍生物色譜峰強(qiáng)度達(dá)到最高，能夠得到最大峰面積.因此，選擇280 ℃作為進(jìn)樣口分解溫度.

圖5 進(jìn)樣口衍生溫度對(duì)水楊酸丁基衍生化的影響

2.4 進(jìn)樣口停留時(shí)間的選擇

離子對(duì)絡(luò)合物在進(jìn)樣口分解生成水楊酸丁酯的過程需要一定時(shí)間，因此，進(jìn)樣口停留時(shí)間也會(huì)對(duì)衍生化效率產(chǎn)生重要影響.本實(shí)驗(yàn)考察進(jìn)樣口停留時(shí)間分別為0.5，0.7，1.0，2.0和5.0 min時(shí)對(duì)衍生化效率的影響.由圖6可知：停留時(shí)間對(duì)衍生效率有重要影響，當(dāng)停留時(shí)間過短，離子對(duì)絡(luò)合物還沒有完全分解成為水楊酸丁酯，隨著停留時(shí)間的增加，水楊酸丁酯的響應(yīng)信號(hào)迅速升高，2 min后，水楊酸丁酯峰面積達(dá)到穩(wěn)定，不再有增加趨勢(shì).因此，最終選擇2 min為最優(yōu)的進(jìn)樣口停留時(shí)間.

圖6 進(jìn)樣口停留時(shí)間對(duì)水楊酸丁基衍生化的影響

2.5 離子對(duì)衍生試劑種類的選擇

實(shí)驗(yàn)主要考察了四丁基硫酸氫銨(TBAHS)，四丁基溴化銨(TBABr)和四丁基碘化銨(TBAI)3種離子對(duì)衍生化試劑對(duì)衍生效率的影響(圖7).結(jié)果表明：3種衍生化試劑對(duì)衍生效果影響沒有明顯差別.考慮到四丁基硫酸氫銨(TBAHS)在文獻(xiàn)報(bào)道中使用較多，應(yīng)用廣泛且相對(duì)成熟，因此，選擇四丁基硫酸氫銨(TBAHS)作為衍生試劑進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn).

圖7 離子對(duì)衍生試劑對(duì)衍生效率的影響

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

本實(shí)驗(yàn)采用質(zhì)量濃度分別為1.0，5.0，10.0，20.0，30.0 μg/mL的水楊酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，在上述優(yōu)化的操作條件下以外標(biāo)法來(lái)進(jìn)行GC-MS定量分析，以被測(cè)物質(zhì)峰面積Y和相對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度X(μg/mL)作線性回歸方程，平行測(cè)定3次，得出線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)Y=79 962X-422.49(r=0.997 8)，分別以3倍信噪比(S/N=3)和10倍信噪比(S/N=10)作為定性檢出限和定量檢出限，從表1中可看出：各組分在此濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.99，符合定量要求，峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.45%，說(shuō)明本方法具有良好的重現(xiàn)性.

2.7 方法的回收率實(shí)驗(yàn)

向已知不同質(zhì)量濃度的樣品中分別添加5.0和10.0 μg/mL的水楊酸標(biāo)樣，按1.3節(jié)的步驟進(jìn)行處理，按照1.2方法進(jìn)行氣相色譜質(zhì)譜檢測(cè)，得到水楊酸的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(表2).

表1 方法的線性范圍、線性關(guān)系、檢出限

表2 樣品加標(biāo)回收率

2.8 實(shí)際樣品的測(cè)定

取5.6 mg阿司匹林泡騰片實(shí)際樣品按照1.3節(jié)的步驟進(jìn)行超聲提取制得待測(cè)樣品溶液.準(zhǔn)確移取2 μL待測(cè)樣品溶液放入直接進(jìn)樣桿專用的微量樣品瓶中，隨直接進(jìn)樣桿進(jìn)行氣相色譜質(zhì)譜檢測(cè).平行測(cè)定3次，取平均值，所測(cè)實(shí)際樣品中水楊酸的含量結(jié)果見表3.結(jié)果顯示：阿司匹林泡騰片中游離水楊酸含量測(cè)定結(jié)果(n=3)含量為2.70%，RSD為9.12%.

表3 阿司匹林泡騰片中游離水楊酸的測(cè)定結(jié)果

3 結(jié) 論

本方法采用直接進(jìn)樣桿在線衍生進(jìn)樣，樣品不需要凈化處理，而樣品中不揮發(fā)或難揮發(fā)的雜質(zhì)基質(zhì)則會(huì)殘留在直接進(jìn)樣桿專用的微量樣品瓶中，不會(huì)污染色譜柱和質(zhì)譜檢測(cè)器.最佳的衍生條件為進(jìn)樣口衍生溫度280 ℃，進(jìn)樣口停留時(shí)間2 min，離子對(duì)衍生試劑為四丁基硫酸氫銨(TBAHS).方法的定性檢出限和定量檢出限分別為0.09 μg/mL和0.28 μg/mL.結(jié)果表明：四丁基硫酸氫銨衍生試劑可以很好地將水楊酸衍生成為水楊酸丁酯，從而使其在儀器上的響應(yīng)信號(hào)增大.該方法具有操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確性高、無(wú)需凈化、適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，可應(yīng)用于阿司匹林泡騰片中游離水楊酸的測(cè)定分析.

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