周晶晶 黃小民 蔣旭宏△ 李 杏

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江 杭州 310006；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310006）

脫氫紫堇堿對(duì)內(nèi)毒素血癥大鼠心肌NF-κB和SOD、MDA的影響*

周晶晶1黃小民1蔣旭宏1△李 杏2

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江 杭州 310006；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310006）

目的 觀察脫氫紫堇堿（DHC）對(duì)內(nèi)毒素血癥大鼠心肌核因子-κB（NF-κB）、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）的影響，探討DHC對(duì)內(nèi)毒素血癥大鼠心肌損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法 采用直接尾靜脈注射內(nèi)毒素的方法建立大鼠內(nèi)毒素血癥心肌損傷模型，50只Wistar大鼠隨機(jī)分成5組：NS對(duì)照組、LPS模型組、DHC低劑量組、DHC中劑量組、DHC高劑量組。采用比色法檢測(cè)血清SOD含量、TBA法測(cè)定血清含量，免疫組化組檢測(cè)心肌組織NF-κB的表達(dá)。結(jié)果 LPS模型組大鼠血清SOD含量明顯減低，而MDA含量明顯增高，心肌組織中NF-κB蛋白水平明顯增高，與NS對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；予DHC干預(yù)后，DHC低、中劑量組可明顯使降低的SOD活性升高，而高劑量組與LPS模型組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；DHC各劑量組可明顯降低血清MDA含量，與LPS模型組相近（P＜0.01）；DHC各劑量組大鼠心肌組織NF-κB蛋白水平明顯下降，與LPS模型組比較差異明顯（P＜0.01）。結(jié)論 DHC可以通過(guò)降低內(nèi)毒素血癥大鼠心肌組織內(nèi)NF-κB活性和提高大鼠抗氧化能力，對(duì)心肌產(chǎn)生保護(hù)作用。

內(nèi)毒素血癥 脫氫紫堇堿 NF-κB SOD MDA

內(nèi)毒素血癥通常導(dǎo)致致死性感染性休克、多器官功能衰竭、彌漫性血管內(nèi)凝血等，病死率極高。脫氫紫堇堿（DHC）是中藥延胡索塊莖中的有效提取物，臨床常用于心血管疾病的治療。筆者既往研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)毒素血癥早期即可出現(xiàn)心肌損傷，而DHC對(duì)其炎癥反應(yīng)有明顯抑制作用，可以保護(hù)受損的心肌組織。本研究擬進(jìn)一步觀察DHC對(duì)內(nèi)毒素血癥大鼠核因子-κB（NF-κB）、超氧化物歧化酶（SOD）及丙二醛（MDA）的影響，從而探討DHC對(duì)內(nèi)毒素大鼠心肌損傷保護(hù)機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物和試劑 清潔級(jí)雄性Wistar大鼠50只由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體質(zhì)量200～220 g，SPF級(jí)。脂多糖（LPS）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司試劑，批號(hào)：H20055058；DHC為大連美侖生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，批號(hào)：20120510；SOD （批號(hào)：20130622）、MDA （批號(hào)：20130406）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物有限公司；NF-κB p65抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，免疫組織化學(xué)兩步法試劑盒、濃縮型DAB試劑盒（ZLI-9032）為北京中杉金橋公司產(chǎn)品。

1.2 造模及給藥 50只Wistar大鼠在實(shí)驗(yàn)室分籠飼養(yǎng)1周，室溫維持25℃，自由進(jìn)食、飲水。以隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為5組：NS對(duì)照組、LPS模型組、DHC低、中、高（2.5、5、10 mg/kg）劑量組，每組 10 只。 LPS 模型組和DHC低、中、高劑量組大鼠分別經(jīng)尾靜脈注入內(nèi)毒素5 mg/kg，NS對(duì)照組給予等容積生理鹽水。在靜脈注完內(nèi)毒素后，DHC低、中、高劑量組大鼠再經(jīng)尾靜脈分別注入DHC溶液2.5、5、10 mg/kg。NS對(duì)照組、LPS模型組給予等容積生理鹽水，方法同DHC干預(yù)組。

1.3 標(biāo)本采集與檢測(cè) 給藥1 h后予25%的水合氯醛溶液麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，分離血清，采用比色法檢測(cè)血清SOD含量、TBA法測(cè)定血清含量，操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)；取左心室心肌組織，以10%甲醛固定，NF-κB的蛋白表達(dá)檢測(cè)采用免疫組化法兩步法，心肌組織石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟至水，高壓熱修復(fù)后予3%H2O2溶液阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶10 min；PBS洗5 min×3次；滴加一抗，37℃孵育 60 min；PBS洗5 min×3次；滴加二抗，37℃孵育 60 min；PBS洗 5 min×3次；DAB顯色、復(fù)染、脫水透明后封片。陽(yáng)性者表現(xiàn)為心肌胞漿內(nèi)棕黃色顆粒沉積，染色完成后，進(jìn)行400倍的顯微照相和MetaMorph/BX41型圖象數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)測(cè)定積分吸光度，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，各組均數(shù)比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血清SOD、MDA含量比較 見(jiàn)表1。LPS模型組大鼠血清SOD含量明顯減低，而MDA含量明顯增高，與NS對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；DHC低、中劑量組SOD水平升高，而高劑量組與LPS模型組相近；DHC各劑量組血清MDA含量均明顯降低，與LPS模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.2 各組大鼠心肌組織NF-κB的表達(dá)比較 見(jiàn)表1，圖1。LPS模型組大鼠心肌組織中NF-κB蛋白水平明顯增高，與NS對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而DHC低、中、高劑量均能使心肌組織中NF-κB蛋白水平明顯下降，與LPS模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表 1 血清 SOD、MDA、含量變化（±s）

表 1 血清 SOD、MDA、含量變化（±s）

與LPS模型組比較，*P＜0.01。

組 別 n NF-κB（MOD）NS對(duì)照組 10 0.16±0.060*LPS模型組 10 0.35±0.014 DHC 低劑量組 10 0.26±0.010*SOD（U/mL） MDA（nmol/mL）179.41±4.82* 3.29±0.34*136.88±4.27 7.04±0.21 158.73±3.45* 4.85±0.43*DHC 中劑量組 10 0.22±0.015*165.58±6.25* 4.37±0.34*DHC 高劑量組 10 135.88±2.34 6.33±0.19* 0.31±0.023*

圖1 各組大鼠心肌組織NF-κB的表達(dá)

3 討 論

近年來(lái)，大量研究表明氧化應(yīng)激是導(dǎo)致心血管系統(tǒng)結(jié)構(gòu)功能異常的重要原因之一。內(nèi)毒素血癥過(guò)程中，單核巨噬細(xì)胞在收到病原體刺激后，產(chǎn)生呼吸爆發(fā)，可以產(chǎn)生大量活性氧（ROS）。ROS是指由氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生，具有化學(xué)性質(zhì)活潑的含氧功能基團(tuán)的化合物，其參與生成ONOO-及 H2O2，ONOO-可激活核聚酶聚合酶，從而造成心肌收縮力的下降［1］。MDA是機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化代謝的毒性產(chǎn)物，是判斷自由基損傷的重要指標(biāo)。測(cè)定組織MDA含量可估計(jì)組織脂質(zhì)過(guò)氧化損傷程度和氧自由基的生成情況，而SOD是體內(nèi)最重要的自由基清除劑之一，能夠催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應(yīng)，消除體內(nèi)自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)對(duì)機(jī)體的損害，減輕自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)對(duì)機(jī)體的損害。NF-κB是一類能與多種基因啟動(dòng)子部位的κB位點(diǎn)特異結(jié)合，并促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)總稱，靜息狀態(tài)下通過(guò)I-κB緊密結(jié)合以無(wú)活性的形成存在于細(xì)胞漿中，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、黏附、凋亡及炎癥反應(yīng)等具有十分重要的調(diào)節(jié)作用［2］，NF-κB是第一個(gè)被證明能被ROS激活的真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子，并且兩者之間存在正反饋效應(yīng)［3］。內(nèi)毒素血癥發(fā)生時(shí)，NF-κB亦能被LPS刺激激活，刺激信號(hào)可使I-κB磷酸化，從而與NF-κB解離，研究顯示LPS刺激后可在1h內(nèi)引起NF-κB的大量激活［4-5］，激活后的NF-κB能誘導(dǎo)表達(dá)血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子和腫瘤壞死因子，這些細(xì)胞因子可直接引起血管內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞的損傷。

本研究采用尾靜脈注射LPS建立內(nèi)毒素血癥大鼠模型，不同劑量DHC進(jìn)行干預(yù)，研究結(jié)果顯示，DHC低、中、高各劑量均可明顯降低血清MDA含量，降低心肌組織中NF-κB含量，與模型組相比差異明顯（P＜0.01），中、高劑量DHC可顯著升高SOD活性，而高劑量組與模型組水平相近。因此筆者認(rèn)為DHC可能是通過(guò)降低大鼠氧化應(yīng)激，增加SOD活性，保護(hù)自由基清除系統(tǒng)，減輕脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)及有害代謝產(chǎn)物對(duì)心肌細(xì)胞的損傷，并且聯(lián)合調(diào)控NF-κB活化，降低NF-κB活性，抑制細(xì)胞因子激活，從而減輕炎癥反應(yīng)，減輕細(xì)胞因子對(duì)心肌細(xì)胞的損傷，達(dá)到對(duì)內(nèi)毒血癥大鼠心肌保護(hù)作用。

［1］Francisco G Soriano，Antonio C．Nogueira，et al.Potential role of poly （adenosine 5′-diphosphate-ribose）polymerase activation in the pathogenesis of myocardial contractile dysfunction associated with human septic shock［J］．Crit Care Med，2006，34（8）：1073-1079.

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Influence of Dehydeocorydaline on the Expression of NF-κB，SOD，and MDA in Myocardium of Rats with Endotoxemia

ZHOU Jingjing，HUANG Xiaomin，JIANG Xuhong，et al.The First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medicine University，Zhejiang，Hangzhou310006，China

Objective:To study the influence of dehydeocorydaline on the expression of NF-κB，SOD，and MDA in myocardium rats with endotoxemia，and to investigate protective mechanism of DHC on myocardial injury model．Methods： Tail intravenous injection of endotoxin was used to establish myocardial injury model in rats with endotoxemia.50 male Wistar rats were randomly divided into 5 groups:NS control group，LPS model group，DHC low dose group，DHC medium dose group，and DHC high dose group.Colorimetry was applied to detect the contents of serum SOD，Total Bile Acids method to detect the content of serum MDA，and immunohistochemical SP method to detect myocardial tissue NF-κB.Results： Serum SOD content in LPS model group significantly reduced，MDA content obviously increased，and NF-κB protein levels in myocardial tissue significantly increased.Compared with NS control group，the difference was statistically significant（P＜0.01）.After DHC intervention，activities of SOD in DHC low，middle dose groups obviously increased，but difference of high dose group had no statistical significance with that of LPS model group.Serum MDA content obviously reduced in each DHC dose group，and there were significant differences compared with LPS model group （P＜0.01）.NF-κB protein levels in each DHC dose group significantly decreased.Compared with LPS model group，the difference was statistically significant （P＜0.01）.Conclusion： DHC can reduce activity of NF-κB in myocardial tissue of rats with endotoxemia and improve the antioxidant ability to protect myocardium.

Endotoxemia；Dehydeocorydaline；NF-κB；SOD；MDA

R285.5

A

1004-745X（2014）07-1231-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.07.009

浙江省中醫(yī)藥管理局項(xiàng)目（2011za034）

△通信作者

2014-04-08）