柏婷 ，伊奧爾 ，湯建國 ，祝琳華 ，喬丹娜 ，孟昭宇

（1.昆明理工大學化學工程學院，昆明 650500； 2.紅塔煙草集團有限責任公司技術中心，云南玉溪 653100）

果膠是煙草重要組成部分，其基本結構是半乳糖醛酸以α-1，4糖苷鍵聚合形成的聚半乳糖醛酸［1］。煙草中果膠含量過高會使煙草燃燒不完全而產(chǎn)生甲醇，甲醇進一步氧化成甲醛、甲酸等，對煙草吸味及安全性產(chǎn)生不利影響［2］，果膠含量已成為評價煙草及煙草制品品質的重要指標，因此準確測定煙草中果膠含量對煙草品質監(jiān)控有重要意義［3–4］。

目前果膠測定方法主要有重量法［5］、咔唑比色法［6］、3，5-二硝基水楊酸（DNS）法［7］、高效液相色譜（HPLC）法［8］、流動分析法［9］、氣相色譜（GC）法［10］及離子色譜法［11–12］。重量法操作復雜，測量結果不穩(wěn)定；咔唑比色法和高效液相色譜法利用酸把果膠酸解成半乳糖醛酸，半乳糖醛酸遇酸易形成內酯，會導致測定結果偏低；氣相色譜法需衍生化，操作復雜；3，5-二硝基水楊酸法和流動分析法利用果膠酶把果膠分解成半乳糖醛酸，3，5-二硝基水楊酸法測量精度不夠，流動分析法穩(wěn)定性不好、試劑用量大。YC/T 346–2010［12］方法選擇性和靈敏度高，但前處理過程復雜，僅除糖和酸化過程就需2次回流、2次過濾、6次洗滌，處理時間約3 h。

筆者采用酸醇溶液加熱回流同時除糖和酸化，利用果膠酶對除糖酸化液和濾渣分別進行酶解，然后采用離子色譜測定合并酶解液中半乳糖醛酸含量，建立了快速、準確測定煙草中果膠含量的方法。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

離子色譜儀：ICS–3000型，附安培檢測器、AS自動進樣器，Chromeleon 6.8色譜工作站，安培檢測器用金工作電極，pH/Ag/AgCl參比電極，鈦對電極，美國Dionex公司；

超純水儀：Millipore型，美國Millipore公司；

電子天平：PG503–S型，感量為 0.1 mg，瑞士Mettler公司；

旋風研磨儀：CyclotecTM1093型，美國FOSS公司；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH–2型，金壇市富華儀器有限公司；

電熱鼓風干燥箱：FED115型，德國賓德公司；

半乳糖醛酸：美國Fluka公司；

果膠酶溶液：10 000 U/mL，諾維信公司；

果膠、無水乙酸鈉、50%氫氧化鈉溶液：美國Sigma公司；

無水乙醇、乙酸、鹽酸：分析純，上海國藥集團化學試劑有限公司；

煙草樣品：紅塔集團；

實驗用水為二次石英蒸餾水，并經(jīng)Millipore超純水儀處理（電阻率≥18.2 MΩ·cm），0.45 μm微孔濾膜過濾。

1.2 樣品前處理

按照 YC/T 31–1996［13］規(guī)定處理樣品及測定水分。稱取煙草樣品0.5 g（精確至0.000 1 g）于250 mL 圓底燒瓶中，加入 100 mL 0.03 mol/L–80%鹽酸–乙醇溶液，加熱回流1 h，抽濾，用熱水潤洗3遍，濾液定容至200 mL，得溶液a；濾渣轉移至200 mL磨口三角瓶中，加入100 mL乙酸–乙酸鈉緩沖溶液和40 μL果膠酶溶液，于53℃水浴酶解3 h，抽濾，濾液定容至200 mL，得溶液b；在100 mL磨口三角瓶中先后加入1 mL溶液a、20 mL乙酸/乙酸鈉緩沖溶液和40 μL果膠酶溶液，53℃水浴酶解1 h，將酶解液轉移至200 mL容量瓶中，加入1 mL溶液b，定容，得溶液c，過0.45 μm濾膜后離子色譜分析。

1.3 色譜條件

色譜柱：Dionex CarboPac PA–10型（250 mm ×4 mm）分析柱，CarboPac PA–10型（50 mm×4 mm）保護柱；柱溫：30℃；淋洗液：水–250 mmol/L NaOH溶液 –1 mol/L NaAc溶液（體積比為 33∶55∶12），流速為1 mL/min；進樣體積：25 μL；檢測器檢測模式：金電極脈沖安培檢測；檢測電位波形：四電位波形。

為了避免酶解液中糖類物質信號強烈，對半乳糖醛酸信號的干擾，電化學檢測器從進樣3 min后開始采集信號。

1.4 果膠含量的計算

在1.3色譜條件下對標樣和樣品中半乳糖醛酸濃度進行分析檢測。采用保留時間定性，外標法定量。按下式計算樣品中果膠含量（以半乳糖醛酸計）：

式中：M——試樣中果膠的質量分數(shù)，%；

n——溶液體積與酶解液取樣體積之比；

c——樣品溶液中半乳糖醛酸的質量濃度，mg/L；

V——溶液體積，L；

m——試樣質量，mg；

W——試樣含水率，%。

2 結果與討論

2.1 底物與酶反應條件的優(yōu)化

2.1.1 除糖和酸化條件選擇

YC/T 346–2010［12］中采用醇化除糖、鹽酸酸化處理樣品，兩步完成約需3 h。本實驗直接采用酸醇混合溶液一步處理樣品，前處理過程中減少1次回流、1次過濾和3次洗滌，同時達到除糖和酸化效果，節(jié)約了1.5 h。實驗發(fā)現(xiàn)酸性過強會使果膠水解，導致除糖酸化液中果膠含量升高，因此應優(yōu)化前處理液的酸濃度。

準確稱取0.5 g煙草樣品3份，分別加入氫離子濃度為0.01，0.03，0.05 mol/L且醇體積分數(shù)為80%的鹽酸–乙醇溶液，加熱回流1 h，固液分離，濾液定容至200 mL，分別取1 mL濾液于100 mL磨口三角瓶中，加入20 mL pH 4的乙酸–乙酸鈉緩沖溶液和40 μL果膠酶溶液，于53℃水浴中酶解1 h，濾液定容至200 mL，用離子色譜法測定。表2數(shù)據(jù)顯示，采用氫離子濃度為0.03 mol/L且醇體積分數(shù)為80%的鹽酸–乙醇溶液處理樣品，除糖酸化液中未檢出半乳糖醛酸，除糖酸化酶解液中半乳糖醛酸含量為1.45%，說明0.03 mol/L醇體積分數(shù)為80%的鹽酸–乙醇溶液不僅可有效去除煙草中的糖類物質，破壞植物細胞壁，殘渣酶解反應更徹底，而且煙草中的果膠僅微弱水解，除糖酸化液中的果膠的含量很低。

表2 不同氫離子濃度條件下半乳糖醛酸含量

2.1.2 酶用量的影響

準確稱取0.5 g煙草樣品6份，分別加入100 mL 0.03 mol/L醇體積分數(shù)為80%的鹽酸–乙醇溶液，加熱回流1 h，固液分離，濾液定容至200 mL，分別取1 mL濾液于100 mL磨口三角瓶中，加入20 mL pH 4的乙酸–乙酸鈉緩沖溶液，再分別加入10，20，30，40，50，60 μL 果膠酶溶液，于 53℃水浴中酶解1 h，進行離子色譜分析。濾渣轉移至200 mL磨口三角瓶中，加入100 mL乙酸–乙酸鈉緩沖溶液，分別加入 10，20，30，40，50，60 μL 果膠酶溶液，于53℃水浴中酶解3 h，進行離子色譜分析。圖1表明當加酶量大于40 μL后，半乳糖醛酸含量幾乎保持不變，故選擇酶用量為40 μL。圖2表明濾渣酶解規(guī)律與濾液相似，酶用量也為40 μL。

圖1 加酶量對濾液中果膠測定結果的影響

圖2 加酶量對濾渣中果膠測定結果的影響

2.1.3 酶解溫度的影響

準確稱取0.5 g煙草樣品6份，除糖酸化后進行固液分離，分別考察 10，25，38，53，65，78℃下果膠酶對濾液和濾渣中果膠水解影響（濾渣和濾液加酶量均為40 μL）。結果如圖3和圖4所示，由圖3、圖4可知，最佳酶解溫度為53℃。

圖3 酶解溫度對濾液中果膠測定結果的影響

2.1.4 酶解時間影響

圖4 酶解溫度對濾渣中果膠測定結果的影響

準確稱取0.5 g樣品6份，除糖酸化后進行固液分離，分別考察 0.5，1，2，3，5，7 h 后果膠酶對濾液和濾渣中果膠水解影響（濾渣和濾液加酶量均為40 μL、酶解溫度均為53℃），結果如圖5和圖6所示。由圖5、圖6可知，濾液最佳酶解時間為1 h，濾渣最佳酶解時間為3 h。

圖5 酶解時間對濾液中果膠測定結果的影響

圖6 酶解時間對濾渣中果膠測定影響

2.2 色譜條件的選擇

樣品中糖類物質響應值過高（信號過強）會對半乳糖醛酸的響應信號造成干擾，因此在進樣3 min后開始采集信號。圖7和圖8分別為煙草樣品在進樣后直接采集信號和進樣3 min后開始采集信號的圖譜。由圖7、圖8可見，進樣3 min后開始采集信號，半乳糖醛酸色譜峰峰形對稱且無拖尾，方便直接積分，因此選擇進樣3 min后開始采集信號。

2.3 工作曲線與檢出限、定量限

稱取30 mg （精確至0.1 mg）半乳糖醛酸標準品，用二次去離子水溶解并定容至100 mL，作為半乳糖醛酸標準儲備液。分別移取50，100，250，500，1 000，2 000 μL半乳糖醛酸儲備液于100 mL容量瓶中，用二次去離子水定容，分別得到質量濃度為0.15，0.3，0.75，1.5，3，6 mg/L的半乳糖醛酸標準工作液，以峰面積y（nC·min）為縱坐標，半乳糖醛酸標準溶液的質量濃度x（mg/L）為橫坐標，建立標準工作曲線。取最低濃度標準溶液重復進樣11次，分別以3倍、10倍標準偏差計算檢出限、定量限。線性方程、相關系數(shù)、檢出限、定量限見表3。

圖7 樣品進樣后直接采集信號色譜圖

圖8 樣品進樣3 min后采集信號色譜圖

表3 半乳糖醛酸的線性范圍、線性方程，相關系數(shù)、檢測限和定量限

2.4 精密度試驗

稱取5份煙草樣品，每份0.5 g （精確至0.1 mg），按照上述前處理和分析條件進行平行測定，測定結果列于表4。由表4可知，測定結果的相對標準偏差為4.92%，表明本方法具有較好的重復性。

表4 精密度試驗結果 %

2.5 回收試驗

稱取3份煙草樣品，每份0.5 g（精確0.000 1 g），分別加入高、中、低3個水平的果膠標準品，按照上述前處理條件和分析條件下進行測定，計算回收率，測定結果見表5。由表5可知，半乳糖醛酸回收率在93.57%～102.29%之間，說明本方法準確度較高。

表5 果膠回收試驗結果

2.6 比對試驗

利用該方法和YC/T 346–2010分別測定18種煙草樣品中的果膠含量，將測定結果進行配對t檢驗，結果見表6。利用表6中數(shù)據(jù)計算，得t=0.091 27，查表t0.025（17）=2.110，t＜t0.025（17），P＞0.05，表明兩種方法測定結果無顯著性差異，說明該方法與標準方法具有良好的一致性。

表6 18種煙草樣品中果膠測定結果 %

3 結語

采用酸醇溶液一步處理煙草樣品，可實現(xiàn)同時除糖和酸化，減少1次回流、1次過濾和3次洗滌前處理，簡化了樣品處理步驟，縮短了樣品處理時間。采用進樣3 min后采集信號，可有效地避免因樣品中糖類物質響應值過高對半乳糖醛酸響應值造成的干擾。該法可用于煙草中果膠含量的批量測定。

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