劉小陽(yáng)

宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽宿州，234000

黃精有效成分的提取及其氧化活性的檢測(cè)

劉小陽(yáng)

宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽宿州，234000

依次利用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行萃取，再用大孔樹(shù)脂進(jìn)行分離，獲得黃精的有效成分。然后利用體外無(wú)細(xì)胞體系，對(duì)黃精的不同萃取物進(jìn)行無(wú)細(xì)胞體系抗氧化活性檢測(cè)。不同有機(jī)相提取物中的自由基(DPPH)和超氧陰離子(O2-)的清除能力以及黃嘌呤氧化酶活性抑制作用的檢測(cè)結(jié)果表明，三種有機(jī)相提取物與抗氧化活性之間存在良好的構(gòu)效關(guān)系。

黃精；有效成分；抗氧化

1 問(wèn)題的提出

黃精為百合科黃精屬植物黃精(Polygonatumsibiricum)、滇黃精(P.kingianum)、多花黃精(P.cyrtonema)和長(zhǎng)梗黃精(P.filipes)的根莖，是一種藥食同源的傳統(tǒng)中草藥[1]。黃精味甘、性平，具有補(bǔ)中益氣、潤(rùn)心肺、補(bǔ)腎益精、強(qiáng)筋骨、安五臟、止寒熱、填精髓等功效。黃精主要含有成分為多糖和皂苷等活性成分[2-3]。其中，主要活性成分為黃精多糖(PSP)。藥理研究表明，黃精多糖能夠增強(qiáng)免疫功能、降低血糖、降低血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化、延緩衰老、抗腫瘤、抗炎、抗病毒等多種生物學(xué)活性，目前已有大量有關(guān)黃精多糖降血糖功能的報(bào)道[4]。為了進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用黃精的藥用價(jià)值，本研究采用有機(jī)溶劑萃取并結(jié)合大孔樹(shù)脂吸附，提取黃精中的主要活性成分多糖和皂苷，并測(cè)定其含量，同時(shí)檢測(cè)其藥理活性，為黃精的藥理學(xué)研究奠定前期基礎(chǔ)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 試劑與儀器

RV-605型真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠(chǎng))；Multiskan GO型酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)；Diaion HP-20型大孔樹(shù)脂(日本三菱合成化學(xué)工業(yè)公司)；752型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海現(xiàn)科儀器有限公司)；BCD-206SVES型海爾冰箱(青島海爾集團(tuán))。

薯蕷皂苷標(biāo)準(zhǔn)品由中國(guó)藥品生物制品檢驗(yàn)所生產(chǎn)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥99.6%；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品由上海化學(xué)試劑公司生產(chǎn)；試劑乙醇、正丁醇、石油醚、乙酸乙酯均為分析純，購(gòu)自中國(guó)上?；瘜W(xué)試劑公司；實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 樣品制備

選用從市場(chǎng)購(gòu)得的優(yōu)質(zhì)黃精塊根(購(gòu)自宿州市中藥材有限責(zé)任公司)，切成長(zhǎng)0.5 cm左右的小塊，放置于鼓風(fēng)干燥箱中在45℃恒溫條件下烘干12 h，然后將溫度升至60℃繼續(xù)烘干8 h后取出。利用粉碎機(jī)將其粉碎，粉碎后呈灰黃色粉末狀，在干燥箱中60℃下干燥2 h至恒重，備用。稱(chēng)取約1 kg黃精粉，用80%乙醇溶解，室溫下提取72 h。將上一步得到的浸提液經(jīng)真空抽濾，得到濾液和濾渣，收集濾液A；將濾渣再用80%乙醇溶解，同樣條件下重復(fù)浸提，再次真空抽濾，得到濾液B。

2.2.2 有機(jī)溶劑萃取

將總濾液(A+B)經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，在適當(dāng)轉(zhuǎn)速下，溫度從室溫慢慢上升至78℃，得到濃縮液C。將濃縮液C置于分液漏斗中，用等體積的石油醚萃取，得到水相和石油醚相，收集石油醚相。將水相再次倒入分液漏斗，用等體積的乙酸乙酯萃取，得到水相和乙酸乙酯相，收集乙酸乙酯相。將水相再次倒入分液漏斗，用等體積的正丁醇萃取，得到水相和正丁醇相，收集正丁醇相。這樣，分別得到水相、正丁醇相、乙酸乙酯相、石油醚相。將上述四相液體分別置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮得4種相的濃縮液。

2.2.3 分離純化

將大孔樹(shù)脂進(jìn)行預(yù)處理、裝柱，然后將上述方法得到的水相和3個(gè)有機(jī)相進(jìn)行過(guò)柱吸附，用70%乙醇洗滌樹(shù)脂，控制流速為每分鐘床層體積的1/25左右，用量為床層體積的5倍，得洗脫液。此步驟分別得到4種過(guò)柱液與4種洗脫液。將得到的4種洗脫液與過(guò)柱液分別合并，濃縮，冷凍干燥，得到各有機(jī)相成分粉劑。

2.2.4 多糖含量分析

2.2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立

稱(chēng)取葡萄糖50 mg，溶解并定容至50 mL容量瓶中，得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 mg/mL)。精密吸取0.5、1.0、2.0、3.0和4.0 mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，搖振，靜置30 min，于490 nm處測(cè)定吸光度。重復(fù)測(cè)定3次，取平均值。以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量x(mg)為橫坐標(biāo)，吸光度y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到回歸方程。

2.2.4.2 多糖含量的測(cè)定

精密稱(chēng)取各有機(jī)相黃精提取物約3 mg，置50 mL量瓶中，加雙蒸水溶解定容，離心，取其上清液檢測(cè)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)照得多糖含量。

2.2.5 薯蕷皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作

2.2.5.1 薯蕷皂苷標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱(chēng)取干燥至恒重的薯蕷皂苷標(biāo)準(zhǔn)品100 μg，置100 mL容量瓶中，用蒸餾水溶解并定容，搖勻，配制成濃度為1 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液[5]，備用。

2.2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作

將薯蕷皂苷標(biāo)準(zhǔn)液分別配成0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 mg·mL-1，分別在326 nm處測(cè)定吸光值，得線(xiàn)性回歸方程。

2.2.6 各有機(jī)相提取物抗氧化活性檢測(cè)

2.2.6.1 清除DPPH自由基的活性檢測(cè)

首先向96孔酶標(biāo)板中加入160 μL 50 μmol/L DPPH自由基的甲醇液，進(jìn)而加入40 μL各有機(jī)溶劑提取物，空白對(duì)照用等量的溶劑所代替，總體積為200 μL。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，搖勻后于室溫下放置30 min，517 nm處測(cè)定吸光值(A0為空白對(duì)照值，AS為試樣測(cè)定值)，用160 μL甲醇與40 μL試樣混合液調(diào)儀器零點(diǎn)，以扣除樣品本身顏色的影響。清除率(C)按下式計(jì)算[6]：

C=[(A0-AS)/A0]×100%

2.2.6.2 超氧陰離子自由基的清除或產(chǎn)生能力的檢測(cè)

采用黃嘌呤與黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)檢測(cè)超氧陰離子產(chǎn)生/清除能力。加入電子傳遞物質(zhì)Gress氏顯色劑，利用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度。操作按照檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，每個(gè)處理樣品做3個(gè)重復(fù)。

2.2.6.3 黃嘌呤氧化酶抑制活性檢測(cè)

稱(chēng)取黃嘌呤(XA)15.21 mg樣品溶于10 mL的PBS中，調(diào)pH值至7.8作為儲(chǔ)備液，濃度為10 mM，將50 μM的黃嘌呤和0.1 U的黃嘌呤氧化酶加上不同質(zhì)量濃度的提取液，反應(yīng)液的總體積為500 μL，在25℃的水浴中反應(yīng)10 min，空白對(duì)照用PBS代替。在295 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光值。抑制率(I)按下式計(jì)算[7]：

I=(1-AS/A0)×100%

健康旅游配套產(chǎn)業(yè)主要集中在餐飲、娛樂(lè)和物流等第三產(chǎn)業(yè)，隨著市場(chǎng)廣度和深度的拓展，與健康旅游相適應(yīng)的服務(wù)體系正在完善。在“互聯(lián)網(wǎng)+醫(yī)療健康”和醫(yī)療大數(shù)據(jù)的背景下，信息化的重要性日益顯現(xiàn)，因旅游與健康領(lǐng)域的信息壁壘尚未打破，信息化的促進(jìn)作用還未有效發(fā)揮。立體化旅游交通格局正在形成，集散中心、景觀公路、休閑綠道等多點(diǎn)開(kāi)花，旅游與交通正面臨著共同轉(zhuǎn)型升級(jí)，以為健康旅游帶來(lái)更多的交通便利。

3 結(jié)果與討論

3.1 黃精提取物中多糖和總皂苷含量的測(cè)定

3.1.1 多糖含量

根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得到回歸方程y=0.160 2x-0.02，R2=0.999 5，見(jiàn)圖1。表明葡萄糖在0.02～0.1 mg范圍內(nèi)與吸光度成良好的線(xiàn)性關(guān)系。根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)所得的回歸方程計(jì)算各提取物中多糖含量，見(jiàn)表1。

圖1 葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

表1 各萃取相過(guò)柱液葡萄糖的檢測(cè)結(jié)果

3.1.2 皂苷含量

根據(jù)薯蕷皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得到回歸方程為y=0.084 1x+0.021 1，R2=0.999 2，表明薯蕷皂苷在0.04～0.2 mg·mL-1范圍內(nèi)表現(xiàn)出良好的線(xiàn)性關(guān)系(圖2)。根據(jù)薯蕷皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)所得的回歸方程計(jì)算得到各提取物中皂苷的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各有機(jī)相總皂苷含量的測(cè)定

圖2 薯蕷皂苷標(biāo)注曲線(xiàn)

3.2 三種提取物不同濃度對(duì)DPPH自由基的清除率

乙酸乙酯相和正丁醇相提取物對(duì)DPPH產(chǎn)生的自由基有清除作用，活性呈劑量依賴(lài)性增強(qiáng)。正丁醇相提取物的活性高于乙酸乙酯相提取物的活性。石油醚相提取物未表現(xiàn)出自由基清除能力(表3)。

表3 三種有機(jī)相提取物對(duì)DPPH自由基的清除率/%

注：ND表示無(wú)DPPH自由基清除。

3.3 對(duì)超氧陰離子自由基的清除的檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，石油醚提取物和乙酸乙酯提取物對(duì)黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶體系所產(chǎn)生的自由基均沒(méi)有清除效果。正丁醇相提取物對(duì)自由基具有一定的清除作用，而且呈劑量依賴(lài)性增加(圖3)。

圖3 三種有機(jī)相提取物在XA/XO體系中超氧陰離子的清除率

3.4 三種有機(jī)相提取物對(duì)黃嘌呤氧化酶酶活影響的檢測(cè)

在三種有機(jī)相提取物中，正丁醇相提取物在黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶反應(yīng)體系中能夠抑制尿酸的生成，說(shuō)明總皂苷對(duì)黃嘌呤氧化酶具有一定的抑制作用。且在150 μg·mL-1和200 μg·mL-1時(shí)的抑制率分別為42.3%和46.2%。而石油醚相和乙酸乙酯相提取物在檢測(cè)濃度范圍內(nèi)沒(méi)有檢測(cè)到對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制作用(圖4)。

圖4 三種有機(jī)相提取物對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制作用

4 結(jié) 論

采用大孔樹(shù)脂吸附法提取了黃精的有效化學(xué)成分，并對(duì)多糖和皂苷的含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明，多糖大部分被除去，而總皂苷的量隨著有機(jī)溶劑極性的增加，含量增加，并且獲得了良好的收率。

有研究表明，黃精可以調(diào)控和增強(qiáng)免疫系統(tǒng)，具有延緩衰老、減少自由基損傷的作用。因此，本研究進(jìn)一步對(duì)三種有機(jī)相提取物進(jìn)行了體外無(wú)細(xì)胞體系抗氧化活性研究，結(jié)果表明乙酸乙酯相和正丁醇相提取物具有明顯的抗氧化活性，這為黃精中單一活性組分的研究提供了一定的理論依據(jù)。

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(責(zé)任編輯：汪材印)

2014-07-28

宿州學(xué)院教授(博士)科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目(szxyjb201206)。

劉小陽(yáng)(1964-)，安徽懷寧人，教授，碩士生導(dǎo)師，主要研究方向：細(xì)胞與分子生物學(xué)。

10.3969/j.issn.1673-2006.2014.12.024

R284.2

A

1673-2006(2014)12-0082-03