李紅艷

(西藏民族學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，陜西 咸陽 712082)

核糖體蛋白在核糖體組裝和蛋白質(zhì)合成中有重要作用.人類中一些核糖體蛋白的異常表達(dá)常引起一些疾病的發(fā)生，如Diamond-Blackfan貧血癥[1]、特納綜合征[2]、聽力喪失[3]和癌癥[4].研究發(fā)現(xiàn)，果蠅中一些核糖體蛋白的突變可引起幼蟲發(fā)育遲緩，剛毛短小、稀疏，生殖力和生活力低下，并隱性致死等特征，這些表型被稱為Minute表型.目前對其解釋為：某一核糖體蛋白基因突變后，引起細(xì)胞生長和增殖率減少[5-6]；編碼核糖體蛋白的基因發(fā)生突變，導(dǎo)致核糖體合成受損，引起蛋白合成速率減少[7].另外，一些核糖體蛋白在細(xì)胞周期、凋亡、DNA損傷修復(fù)等過程中也有著重要作用，但這些作用和該核糖體蛋白在核糖體組裝和蛋白質(zhì)合成中的作用無關(guān).

L22是核糖體60 S大亞基的組成成分，除了自身參與核糖體組裝和蛋白質(zhì)合成外，并與其他多亞基核糖核蛋白顆粒一起發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能[8].另外，L22通過與病毒調(diào)節(jié)蛋白如ICP-4和ICP-22相互作用[9]，調(diào)節(jié)病毒早期基因EAP的轉(zhuǎn)錄[10].L22誘導(dǎo)p53表達(dá)，選擇性阻止αβT細(xì)胞發(fā)育[11].果蠅Kc細(xì)胞刪除L22后，通過與組蛋白H1相互作用抑制基因的轉(zhuǎn)錄[12].但有關(guān)L22在果蠅發(fā)育中的作用及機(jī)制還不清楚.本研究證實，L22對于果蠅正常發(fā)育是不可缺少的，且主要是通過細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯的方式發(fā)揮作用的.

1 材料和方法

1.1 L22 RNAi轉(zhuǎn)基因果蠅的獲取和飼養(yǎng)

以果蠅L22 cDNA編碼區(qū)為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增(上游引物5-caagcggccgcggtgaacaacctgggcaa-3；下游引物5-ccggaattcgcatcgtcgtcctcatcgtc-3).將擴(kuò)增產(chǎn)物通過Not I和EcoR酶切位點克隆到SympUAST-w載體中，稱為L22-SympUAST-w.通過顯微注射法將L22-SympUAST-w質(zhì)粒注射到果蠅w1118胚胎中，經(jīng)多步篩選最終獲得L22RNAi轉(zhuǎn)基因果蠅.為了驅(qū)動L22在果蠅中特異性干擾，實驗中用到的其他商品化果蠅品系有Hsp70-Gal4，act5c-Gal4，ey-Gal4和 vg-Gal4.果蠅飼養(yǎng)在18 ℃/25 ℃玉米粉-蔗糖培養(yǎng)基上.

1.2 果蠅幼蟲體長測量

L22RNAi雌蠅與Hsp70-Gal4雄蠅在25 ℃下雜交，間隔1 h產(chǎn)卵，1 h后將果蠅轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基下使其再次產(chǎn)卵，依次循環(huán).產(chǎn)卵24 h后，將幼蟲在37 ℃熱激30 min.之后每隔24 h隨機(jī)收集1次幼蟲，每組收集至少10只，至對照組發(fā)育到蛹期.使用MZ16體視顯微鏡對幼蟲拍照.利用MetaMorph軟件統(tǒng)計幼蟲體長.

1.3 吖啶橙染色

在PBS緩沖液中解剖L22RNAi與vg-Gal4雜交后的三期幼蟲翅膀discs.解剖好后立即放到4 ℃果蠅細(xì)胞培養(yǎng)基中，使其維持正常的生理環(huán)境.之后轉(zhuǎn)移到載玻片上，并用100 μL的培養(yǎng)基洗1次.室溫下，以1 μg/mL 吖啶橙(sigma)染色5 min后，即刻在熒光鏡下收集數(shù)據(jù).

1.4 果蠅S2細(xì)胞中干擾L22

PCR擴(kuò)增果蠅L22編碼序列(上游引物[含有1個T7啟動子]：5-taatacgactcactatagggagaatggctcctaccgccaagacc-3；下游引物5-taatacgactcactatagggagattactcggcatcgtcgtcctc-3).PCR產(chǎn)物純化后作為模板，再通過MEGAscrip T7 (Ambion)試劑盒生成單鏈RNA(ssRNAs).ssRNAs在65 ℃中退火，孵育30 min，自然降溫至室溫即生成雙鏈RNA(dsRNAs).經(jīng)乙醇沉淀，重懸在一定量的無RNA酶水中.再經(jīng)凝膠電泳對其定量，-80 ℃保存?zhèn)溆?

S2細(xì)胞培養(yǎng)在Schneider 果蠅基本培養(yǎng)基(Gibco)中，補(bǔ)加終質(zhì)量濃度為100 g/L的胎牛血清(Gibco)，160 μg/mL 青霉素，250 μg/mL 鏈霉素和4 mmol/LL-谷氨酰胺(Sigma)，25 ℃培養(yǎng).依照之前的方法[12]在S2細(xì)胞中對L22 進(jìn)行干擾.用無血清培養(yǎng)基將S2 細(xì)胞以1×106個/mL密度種植在35 cm 培養(yǎng)瓶中(Corning).室溫，1 mL無血清培養(yǎng)基加終質(zhì)量濃度為5 μg/mL L22 dsRNA撫育60 min.隨后補(bǔ)加含有血清的正常培養(yǎng)基2 mL繼續(xù)培養(yǎng).同時以GFP dsRNA作為對照組，處理對照組細(xì)胞.在處理后的第4和第8天收集細(xì)胞，用作實驗.

1.5 RT-PCR

根據(jù)試劑盒(Qiagen)要求提取收集到的細(xì)胞總RNA.并對提取的RNA進(jìn)行DNase(TaKaRa)處理，以防止基因組DNA污染.以提取的RNA為模板，用M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)和oligo-dT 引物合成cDNA.PCR擴(kuò)增條件(25 μL 反應(yīng)體系)：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃， 30 s，60 ℃，30 s，72 ℃，45 s，30 個循環(huán)；72 ℃延伸8 min.同時實驗中為了進(jìn)一步排除基因組污染的干擾，一并檢測了每一組RNA 樣品在沒有加反轉(zhuǎn)錄酶的情況下參照基因的表達(dá).用到的引物見表1.

表1 RT-PCR引物

1.6 統(tǒng)計分析

所有實驗重復(fù)在3次以上.數(shù)據(jù)使用Excel 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析.組間樣本均數(shù)比較采用t檢驗，以P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義．

2 結(jié)果

2.1 減少L22表達(dá)延遲果蠅幼蟲發(fā)育

實驗首先用act5c-Gal4驅(qū)動L22表達(dá)廣泛減少，以初步了解L22在果蠅發(fā)育中的作用.結(jié)果果蠅死在胚胎期，而對照組發(fā)育正常.同時用Hsp70-Gal4驅(qū)動子誘導(dǎo)性驅(qū)動L22沉默(方法見材料部分).L22RNAi/Hsp70-Gal4從一期到三期幼蟲均發(fā)育延遲，持續(xù)10～12 d，最后死在三期幼蟲期；對照組發(fā)育正常，在幼蟲期持續(xù)6～7 d，之后發(fā)育成蛹和成蟲.在早48 h，L22RNAi/Hsp70-Gal4生長與對照組比沒有明顯變化，而72 h后，較對照組體長明顯變小(圖1 a，b).由此說明L22是果蠅早期發(fā)育所必須的.

2.2 減少L22表達(dá)引起果蠅眼和翅膀生長缺陷

實驗進(jìn)一步用特異性驅(qū)動L22在眼睛和翅膀中表達(dá)沉默的ey-Gal4和vg-Gal4驅(qū)動子.果蠅復(fù)眼由一定數(shù)目的單眼和特異性視網(wǎng)膜細(xì)胞精確排列組成.復(fù)眼已成為一個很好的研究細(xì)胞增殖和細(xì)胞存活的系統(tǒng)[13].統(tǒng)計了500只L22RNAi/ey-Gal4果蠅，其表型可分為3類：第1類(占17%)與正常對照組比沒有顯著差異.第2類(占6%)眼表型與對照組相比較小，可以從蛹中正常孵育出來(圖2a).而第3類(占77%)死在蛹期，解剖發(fā)現(xiàn)這些果蠅身體其他部位發(fā)育完整，只是缺少頭部結(jié)構(gòu).所有L22RNAi/vg-Gal4果蠅的翅膀變小而且多褶皺(圖2c).這些異常表型暗示：L22干擾后引起眼和翅膀discs發(fā)育不完全，可能是由細(xì)胞增殖阻滯或細(xì)胞死亡引起的.

a.熱激后L22RNAi/Hsp70-Gal4 幼蟲和對照組幼蟲長度比較；b.前48 h，L22RNAi/Hsp70-Gal4幼蟲和對照組體長相差不顯著; 72 h 后，L22RNAi/Hsp70-Gal4 幼蟲生長顯著慢于對照組(P<0.05).圖1 減少L22表達(dá)阻滯果蠅幼蟲發(fā)育Fig.1 Decreased expression of L22 caused the Drosophila larvae growth arrest

2.3 減少L22表達(dá)降低S2細(xì)胞數(shù)目和果蠅翅膀disc中出現(xiàn)細(xì)胞凋亡

已知細(xì)胞數(shù)目反應(yīng)了細(xì)胞增長和細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系[14].所以在果蠅S2細(xì)胞中干擾L22表達(dá)，以GFP作為對照，統(tǒng)計細(xì)胞數(shù).結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在L22干擾后S2細(xì)胞數(shù)目減少(圖3a).且這種變化隨著時間的延長越來越明顯.這一結(jié)果與異常的眼和翅膀表型吻合.表明L22RNAi后影響了果蠅的發(fā)育，且可能是通過細(xì)胞凋亡的方式完成的.同時吖啶橙(細(xì)胞凋亡熒光染料)染色實驗證實，在L22RNAi/vg-Gal4三期幼蟲的翅膀discs中確實有明顯的細(xì)胞凋亡信號出現(xiàn)(圖2d).

a.與野生型相比，6%L22RNAi/ey-Gal4 眼睛變小，77%無頭；b.在統(tǒng)計的500只果蠅中L22RNAi/ey-Gal4各種表型所占的比例；c.L22RNAi/vg-Gal4后代翅膀缺陷；d.吖啶橙染色顯示，L22RNAi/vg-Gal4 三期幼蟲的翅膀 disc 細(xì)胞出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象.圖2 減少L22表達(dá)造成果蠅眼睛和翅膀缺陷Fig.2 Eye and wing defects in L22-depleted flies

2.4 L22刪除后細(xì)胞凋亡/細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá)異常

以上結(jié)果表明，L22干擾后引起了細(xì)胞凋亡，而凋亡與細(xì)胞周期緊密相關(guān).因此通過RT-PCR檢測了與細(xì)胞凋亡相關(guān)基因(hid，reaper，dcp-1和p53)和細(xì)胞周期相關(guān)基因(MCM5，cdc45，incenp和cyclinB)在S2細(xì)胞中L22干擾后的變化情況.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，刪除L22，引起hid，reaper，dcp-1和p53基因表達(dá)水平升高(圖3b)，而這種變化與他們各自在細(xì)胞凋亡中的作用是一致的.已知p53是一腫瘤抑制蛋白，在各種應(yīng)激條件下均可以開啟凋亡的發(fā)生[2]，通常是通過刺激細(xì)胞色素C釋放來激活caspase活性引起的[15].Dcp-1是果蠅caspase家族的一個成員，也在細(xì)胞凋亡過程中有著重要作用[16].Reaper和hid是果蠅中另外2個與細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因[17-18]，它們可以直接或間接通過激活p53來參與凋亡[19]，另外發(fā)現(xiàn)它們在發(fā)揮細(xì)胞凋亡過程中也激活了caspase通路[2-21].

另外，L22RNAi后G1-S期的MCM5與cdc45 和G2-M期的incenp與cyclinB表達(dá)水平分別減少(圖3c).MCM5是p53的一個轉(zhuǎn)錄抑制target，在G1-S期中有著重要作用[22].細(xì)胞分裂周期蛋白45 (cdc45)對于細(xì)胞周期起始以及DNA復(fù)制延伸都有著重要作用[23].研究發(fā)現(xiàn)，Cdc45與MCM5/cdc46，MCM7/cdc47和ORC[24]相互作用.Cyclin B 有控制細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂期的作用，減少cyclin B表達(dá)導(dǎo)致G2期阻滯，而且該過程受到p53依賴的轉(zhuǎn)錄抑制調(diào)控[25].Incenp在細(xì)胞分裂過程中有重要作用.研究發(fā)現(xiàn)Incenp與Aurora B 和survivin 形成Aurora B/incenp/survivin復(fù)合體，在染色體正常分離過程中發(fā)揮作用[26-28].在黑色素細(xì)胞中，p53可以通過直接與survivin啟動子結(jié)合或者激活p21來抑制survivin表達(dá)[29].因此，Incenp與p53之間可能有一種負(fù)相關(guān).

a.L22 RNAi后S2細(xì)胞生長受到抑制，而GFPRNAi對照組細(xì)胞生長正常；b.L22RNAi導(dǎo)致p53，hid，dcp-1和reaper的轉(zhuǎn)錄水平上升； c.actin轉(zhuǎn)錄正常，而MCM5，cdc45，cyclin B和incenp轉(zhuǎn)錄水平均下降.圖3 S2細(xì)胞中減少L22表達(dá)引起細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá)異常Fig.3 Abnormal expression of the genes related to apoptosis and cell cycle in L22-depleted S2 cells

綜上所述，L22對于果蠅正常發(fā)育是不可缺少的，L22RNAi后主要是通過細(xì)胞凋亡的方式來影響果蠅發(fā)育的.

致謝：感謝清華大學(xué)孫方霖教授給予的實驗指導(dǎo)和經(jīng)費支持；感謝清華大學(xué)陳蘇同學(xué)在實驗過程中所給的幫助.

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