周波林(北海市人民醫(yī)院藥劑科,廣西 北海 536000)
1997年,Hearse首次提出缺血-再灌注損傷(Ischemiareper fusion injury,I/R)概念。所謂I/R,是指細胞因缺血發(fā)生可逆性、可存活的損傷,但缺血糾正后組織或器官重獲血流灌注或氧供,這種損傷不但沒有減輕反而加重并引起細胞死亡或進一步的功能障礙的病理改變[1]。
細胞凋亡(Apoptosis)是細胞基因調(diào)控的細胞內(nèi)分子水平的編程性活動,因其啟動和進程受一定程序的控制,因此又稱之為程序性細胞死亡(Programmed cell death)。凋亡過程由多種調(diào)節(jié)基因共同參與完成,尤其是一些原癌基因和腫瘤前體基因。在眾多的凋亡相關(guān)基因中,B細胞淋巴瘤/白血病基因-2(Bcl-2)基因蛋白家族目前最受關(guān)注[1]。越來越多的研究證實,細胞凋亡是I/R造成組織、器官失去功能的主要原因,由Bcl-2蛋白家族參與調(diào)控的細胞凋亡在I/R性疾病治療中的地位也越來越重要[2]。近年來,中藥有效成分調(diào)控Bcl-2基因抗器官I/R的研究日益受到關(guān)注,現(xiàn)就這一領(lǐng)域的研究進展作一綜述。
Bcl-2基因,它最早是在1985年由Tsujinoto等從濾泡性淋巴瘤中分離鑒定得到的。它是一種直接調(diào)節(jié)細胞凋亡的線粒體膜整合蛋白,其結(jié)構(gòu)含有3個外顯子和2個內(nèi)含子。Bcl-2家族可以分為兩類:一類是抑制細胞凋亡基因,如Bcl-2、Bcl-xl,EB病毒基因BHRF-1、MCL-1;另一類是促細胞凋亡基因,如Bax、Bel.xs、Bad、Bak等。免疫電鏡顯示它存在于細胞內(nèi)核膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體膜中,通過調(diào)控線粒體細胞結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定性而發(fā)揮凋亡“主開關(guān)”的作用[3]。
研究表明,Bcl-2抗凋亡的機制可能有:(1)Bcl-2可作為一種抗氧化劑,調(diào)節(jié)細胞的氧化還原狀態(tài),從而通過抑制氧自由基的產(chǎn)生而抑制細胞凋亡;(2)Bcl-2可與Bax結(jié)合形成異源二聚體Bcl-2/Bax抑制凋亡發(fā)生,以此來抑制Bax的促凋亡作用;(3)Bcl-2通過改變胞內(nèi)細胞器的Ca2+流而抑制凋亡,Ca2+可以激活與細胞凋亡密切相關(guān)的內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶;(4)Bcl-2可改變p53和cdc2及cdk2等細胞周期調(diào)節(jié)蛋白的核-胞漿轉(zhuǎn)運,從而抑制細胞凋亡;(5)Bcl-2蛋白調(diào)節(jié)線粒體膜上通透性轉(zhuǎn)換孔(Permeability transition pores)來改變線粒體膜的通透性,防止一些線粒體內(nèi)容物如細胞色素C釋放入胞質(zhì)而激活半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3),進而抑制細胞凋亡;(6)Bcl-2可直接和凋亡蛋白活化因子1(Apoptotie protease activating factor-1,Apaf-1)結(jié)合,阻止凋亡蛋白酶的激活[1,4]。
2.1.1 葛根素 葛根素是從為豆科植物葛Pueraria lobata(Willd.)Ohwi、野葛P.thunbergiana Benth.的干燥根中提取的異黃酮類化合物。葛根素抗大鼠肝I/R的體內(nèi)實驗研究顯示,在再灌注3、6、24、48 h的各時段,通過透射電鏡觀察,I/R組發(fā)現(xiàn)較多的肝細胞調(diào)亡現(xiàn)象,24h時較典型,可見核膜破裂、核碎裂及凋亡小體的形成,治療組再灌注后各時間點Bcl-2蛋白表達呈現(xiàn)持續(xù)高表達,Caspase-3表達呈現(xiàn)持續(xù)減弱,與I/R組比較有統(tǒng)計學意義,這說明葛根素可以通過上調(diào)Bcl-2表達水平,抑制肝I/R細胞凋亡[5]。研究發(fā)現(xiàn),對肝I/R引起的心肌組織損傷,葛根素能通過上調(diào)Bcl-2蛋白表達,下調(diào)心肌組織C-fos表達,降低心肌細胞凋亡指數(shù),使心肌水腫減輕[6]。同樣,對于由肝I/R引起的腦細胞凋亡,葛根素亦能通過上調(diào)腦細胞Bcl-2蛋白表達,下調(diào)腦組織C-fos基因(腦I/R后細胞代謝改變的敏感指標)表達,降低腦細胞凋亡指數(shù),使腦水腫減輕[7]。葛根素對兔肺I/R具有治療作用,葛根素治療組在血清超氧化物歧化酶(SOD)活力、丙二醛(MDA)含量、肺濕干重比(W/D)、肺泡損傷數(shù)及肺組織細胞凋亡指數(shù)等各方面優(yōu)于對照組和I/R組,差異有統(tǒng)計學意義。免疫組化檢測發(fā)現(xiàn),葛根素可上調(diào)肺組織Bcl-2蛋白,下調(diào)Bax和Caspase-3蛋白表達,從而抑制肺再灌注后肺組織細胞的異常凋亡,減輕肺I/R[8]。經(jīng)葛根素治療的心I/R模型大鼠,肌酸肌酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)和血清天冬酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)水平都顯著降低,心肌細胞比較完整;同時,心肌組織的Bcl-2蛋白表達明顯增強,Bax蛋白表達明顯下降[9-10]。有研究顯示,葛根素能升高大鼠腦I/R后Bcl-2表達,降低Bax表達,Bcl-2/Bax比值升高,經(jīng)葛根素治療后大鼠神經(jīng)細胞凋亡數(shù)明顯減少,凋亡細胞數(shù)與Bcl-2/Bax比值呈負相關(guān)[11]。
2.1.2 燈盞花素 燈盞花素是從菊科植物燈盞細辛Erigeron breviseapus(Vant.)Hand.Mazz.中分離得到的黃酮類成分。研究顯示,燈盞花素能抗大鼠心肌I/R,升高心肌組織SOD,使MDA處于較低的水平,改善心肌細胞的超微結(jié)構(gòu),抑制大鼠心肌細胞Bax蛋白表達,提升Bcl-2蛋白表達[12]。其作用機制為通過調(diào)控Bax/Bcl-2的比值、抗氧自由基損傷、抑制I/R心肌細胞發(fā)生凋亡,從而減輕I/R。在燈盞花素對大鼠腎臟冷I/R的保護作用實驗中發(fā)現(xiàn),實驗組較對照組大鼠的超微結(jié)構(gòu)中線粒體損傷減輕,Bcl-2表達上調(diào),bax表達下調(diào),Bcl-2/Bax的比值升高,細胞凋亡指數(shù)下降[13]。在腎臟I/R中最易受損傷的部位——腎曲小管,這種差異最明顯。據(jù)報道,燈盞花素可通過上調(diào)大鼠I/R時子宮組織細胞Bcl-2蛋白的表達,提高子宮I/R后SOD活性,抑制子宮I/R引起的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和清除氧自由基的效應(yīng),保護子宮組織免受黃嘌呤、黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)產(chǎn)生的氧自由基損傷[14]。
2.1.3 菟絲子總黃酮 菟絲子總黃酮是由旋花科植物菟絲子Cuseuta chinensis Lam.的干燥成熟種子分離得到的黃酮類物質(zhì)。實驗研究證實,菟絲子黃酮對大鼠心肌I/R具有保護作用,與模型組比較,菟絲子黃酮預處理能夠減少心肌酶CK、LDH含量,上調(diào)Bcl-2蛋白表達,下調(diào)Caspase-3蛋白表達,抑制心肌細胞凋亡,與消心痛效果相近[15]。
2.1.4 紅花黃色素 紅花黃色素是從菊科植物紅花Carthamus tinctorius L.干燥管狀花分離得到的單查爾酮。實驗研究發(fā)現(xiàn),紅花黃色素可明顯減輕腦I/R時大鼠的神經(jīng)功能障礙,明顯減少了腦I/R中過量表達的iNoS,減輕遲發(fā)性神經(jīng)元壞死,保存神經(jīng)細胞功能,同時Bcl-2蛋白表達升高、Bax蛋白表達降低、Bcl-2/Bax比值升高。這說明紅花黃色素對腦I/R的保護作用與調(diào)控Bcl-2基因的表達有關(guān)[16]。
2.2.1 川芎嗪 川芎嗪是從傘形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort的干燥根莖提取分離的一種生物堿。研究顯示,川芎嗪可明顯減輕I/R引起的腦組織結(jié)構(gòu)方面的損傷和改善神經(jīng)損傷表現(xiàn),川芎嗪治療組梗死體積占全腦比例少于I/R組,差異有統(tǒng)計學意義[17]。與I/R組相比,川芎嗪干預后大鼠的Bcl-2表達明顯增高,Caspase-3蛋白的表達水平顯著下降。提示川芎嗪可腦細胞上調(diào)Bcl-2蛋白水平和下調(diào)Caspase-3蛋白水平,從而抑制細胞凋亡,減輕腦組織的損傷[18]。大鼠心肌I/R后,心肌中的SOD活性降低,MDA大量生成,同時心肌細胞發(fā)生凋亡。川芎嗪可以通過上調(diào)心肌細胞Bcl-2水平,減輕氧自由基損傷,并且提高Bcl-2/Bax的比值,從而減輕I/R誘發(fā)的心肌細胞凋亡[19]。在對兔肺I/R模型研究中發(fā)現(xiàn),川芎嗪治療組較I/R組血清SOD活力明顯增加,MDA明顯減少,肺組織水腫減輕,肺泡損傷減少,肺組織Bcl-2表達水平上調(diào)、Bax表達水平下調(diào)。提示川芎嗪可以通過上調(diào)Bcl-2表達水平提高內(nèi)源性清除氧自由基的能力,產(chǎn)生抗氧化應(yīng)激,對兔肺I/R細胞凋亡產(chǎn)生保護作用[20]。
2.2.2 青藤堿 青藤堿是從防己科植物青藤Sinomenium actum Rehd.et Wils.的根和莖分離得到的生物堿。糖尿病大鼠腦I/R經(jīng)青藤堿治療后,可明顯減少腦梗死體積,減輕缺血造成的病理損害,并且高劑量青藤堿的腦保護效果更顯著。青藤堿能上調(diào)Bcl-2蛋白的表達、抑制Caspase-3的表達與活化,從而減少神經(jīng)元凋亡的發(fā)生[21]。
2.2.3 小檗堿 小檗堿是從為毛茛科植物黃連Coptis chinensis Franch.、三角葉黃連Coptis deltoidea C.Y.Cheng et Hsiao或云連Coptis teeta Wall.的干燥根莖中提取的苯并異喹啉類季銨型生物堿。在I/R的大腦中動脈栓塞大鼠模型中,小檗堿治療組神經(jīng)功能評分明顯低于手術(shù)對照組,腦梗死體積較模型組顯著縮小。小檗堿組大鼠額頂部皮質(zhì)Bcl-2、Caspase-3免疫陽性細胞數(shù)與模型組相比差異明顯;同時,小檗堿高劑量組大鼠額頂部皮質(zhì)Bci-2、Caspase-3免疫陽性細胞數(shù)與低劑量組比較差異明顯。小檗堿可通過上調(diào)皮質(zhì)Bcl-2的表達、抑制Caspase-3的表達發(fā)揮腦保護作用[22]。
2.3.1 黨參皂苷 黨參皂苷是從桔??贫嗄晟荼局参稂h參Codonopsispilosula(Franch.)Nannf.的干燥根分離得到的皂苷類物質(zhì)。通過大鼠移植腎I/R模型,觀察黨參皂苷對大鼠血尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)水平和腎細胞凋亡指數(shù)(AI)的影響,同時檢測與細胞凋亡有關(guān)的基因Bcl-2和Bax mRNA在腎組織中的相對表達量。結(jié)果顯示,黨參皂苷干預組BUN和Cr值明顯下降,腎細胞凋亡指數(shù)明顯下降,移植腎組織中Bcl-2 mRNA表達顯著增加,Bax mRNA表達明顯下降。提示黨參皂苷通過對Bcl-2基因表達的上調(diào)和對Bax基因表達的下調(diào),從而抑制腎細胞的凋亡[23]。
2.3.2 酸棗仁皂苷A 酸棗仁皂苷A是由鼠李科植物酸棗Ziziphus psinosa Hu的干燥成熟種子分離得到的皂苷。文獻報道,在對大鼠心肌I/R研究中發(fā)現(xiàn),模型組心肌組織病理損傷明顯,有明顯的心律失常,心肌Bcl-2表達顯著降低,Bax表達顯著升高[24]。酸棗仁皂苷A干預后,心肌組織病理改變減輕,心律失常評分顯著降低,心肌組織Bcl-2表達顯著升高,Bax表達顯著降低,與模型組比較有顯著性差異。提示酸棗仁皂苷A可通過抑制再灌注損傷后大鼠心肌組織Bcl-2降低和Bax表達的升高,對心肌I/R起到保護作用。
2.3.3 人參皂苷Rg1人參皂苷Rg1是從五加科植物人參Panax ginseng C.A.Mey.根中分離得到的四環(huán)三萜類衍生物。大鼠腦I/R模型中,造模前給予人參皂苷Rg1,顯著減輕大鼠腦部損傷,提高神經(jīng)功能缺損評分,這與其能促進腦組織Bcl-2表達、抑制Bax表達,提高Bcl-2/Bax比值而抑制細胞凋亡有關(guān)[25]。
2.3.4 七葉皂苷鈉 七葉皂苷鈉是從七葉樹科植物天師栗Aesulus wilsoniirehd Rehd.干燥成熟果實(婆羅子)中提取的三萜皂苷鈉鹽。研究七葉皂苷鈉對大鼠腦I/R模型的保護作用發(fā)現(xiàn),經(jīng)七葉皂苷鈉干預后,大鼠神經(jīng)細胞凋亡數(shù)明顯低于模型組及生理鹽水組,且凋亡高峰時下降明顯[26]。同時,Bcl-2蛋白表達上調(diào),Caspase-3蛋白的表達則明顯受到抑制,七葉皂苷鈉可通過上調(diào)Bcl-2表達,下調(diào)Caspase-3的表達,發(fā)揮對腦I/R的保護作用。
2.4.1 姜黃素 姜黃素是一種從姜科姜黃屬(Curcuma longa)植物姜黃、莪術(shù)、郁金等的根莖中提取得到的酸性多酚類物質(zhì)。有文獻報道,與損傷模型組比較,姜黃素治療組明顯改善大鼠神經(jīng)功能的受損程度和減少腦梗死體積。姜黃素可上調(diào)Bcl-2蛋白的表達,下調(diào)Bax蛋白表達,增大Bcl-2/Bax比值,減少Bax同源二聚體的形成,從而降低腦I/R后神經(jīng)細胞凋亡數(shù)目[27]。
2.4.2 白藜蘆醇 白藜蘆醇是從虎杖科蓼科虎杖屬多年生草本植物虎杖Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.的干燥根莖和根分離得到的多酚物質(zhì)。在治療大鼠全肝I/R模型中發(fā)現(xiàn),白藜蘆醇能使肝組織病理損害減輕,細胞凋亡指數(shù)降低,Bcl-2蛋白表達增多,Bax及Caspase-3蛋白表達減少。提示白藜蘆醇對Bcl-2的調(diào)控是抗肝I/R的分子基礎(chǔ)[28]。通過建立心肌I/R模型,觀察白藜蘆醇對心肌的保護作用實驗發(fā)現(xiàn),白藜蘆醇可以抑制大鼠血清中LDH的升高,提高SOD的活力,降低MDA的生成量,從而保護心肌,減輕心肌細胞損傷,這與白藜蘆醇能上調(diào)Bcl-2蛋白表達、下調(diào)Bax蛋白表達有關(guān)[29]。
2.4.3 丹酚酸B 丹酚酸B是從唇形科植物丹參Salvi-a miltiorrhiza Bge.的根及根莖提取而得的酚酸。觀察丹酚酸B對大鼠腦I/R后腦組織Bcl-2和Bax蛋白表達的影響發(fā)現(xiàn),與模型組相比,丹酚酸B顯著增強I/R后Bcl-2蛋白表達,同時顯著降低Bax蛋白表達,從而起到抗腦細胞凋亡、保護腦神經(jīng)的作用[30]。
丹參酮ⅡA(TanshinoneⅡA)是從丹參的干燥根及根莖中提取的二萜醌類化合物。經(jīng)丹參酮ⅡA干預的腦I/R模型大鼠,腦細胞凋亡顯著減少,腦梗死體積明顯縮小,神經(jīng)行為學評分(NBS)提高,其機制為丹參酮ⅡA通過上調(diào)Bcl-2的表達、下調(diào)Bax的表達,增加谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活性清除氧自由基,從而抑制細胞凋亡[31]。有研究顯示,丹參酮ⅡA能上調(diào)大鼠肺細胞Bcl-2的表達和下調(diào)Caspase-3表達,抑制肺I/R后肺組織細胞的凋亡,改善肺組織濕干重比(W/D,反映肺水腫指標)、細胞凋亡率等指標,從而具有抗肺I/R的作用[32]。
綜上所述,大量的實驗研究證實了中藥有效成分能夠通過調(diào)控Bcl-2基因抑制細胞凋亡,從而起到抗器官I/R損傷的作用。這些研究將為中藥在治療I/R疾病方面提供更為全面的分子生物學實驗基礎(chǔ)。對中藥有效成分在防治I/R疾病的結(jié)構(gòu)-效應(yīng)關(guān)系、劑量-效應(yīng)關(guān)系的研究,都將成為未來研究的重點和值得探討的問題。
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