孫 晶，邵曉梅，方 芳，沈 醉，方劍喬

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院針灸神經(jīng)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310053)

臨床上常見由于組織損傷引起的炎性疼痛，是嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量的臨床癥狀。因此，近年來對炎性痛的基礎(chǔ)研究日益增多，常用的炎性痛模型有足底部注射角叉菜膠、弗氏佐劑、甲醛等。大鼠足跖底部注射角叉菜膠是經(jīng)典急性炎性痛模型[1-3]，可誘發(fā)大鼠足跖底部組織紅腫及持續(xù)性炎性痛。多數(shù)研究將機(jī)械痛閾和足跖腫脹度作為炎性痛程度的評價(jià)指標(biāo)[4,5]，但足跖腫脹度的測量因其影響因素較多，很難準(zhǔn)確評估病情變化，目前使用上已有減少趨勢，僅憑機(jī)械痛閾這一單一指標(biāo)無法完全客觀地評估炎性痛程度。因此，在基礎(chǔ)研究中再尋找出客觀、有效、接受度高的評估方法勢在必行。有研究表明，角叉菜膠誘導(dǎo)的急性炎癥模型會導(dǎo)致局部微循環(huán)障礙、毛細(xì)血管擴(kuò)張、局部血流量增多[6]。這說明急性炎癥發(fā)生后，除了疼痛以外，局部皮膚血流灌注量亦會發(fā)生改變。而急性炎性痛與局部血流灌注量的變化是否存在相關(guān)性，目前未見報(bào)道。本課題采用角叉菜膠誘導(dǎo)的急性炎性痛模型初步探討機(jī)械痛閾與局部皮膚血流灌注量的動態(tài)變化，分析這兩者是否具有相關(guān)性，以此為炎性痛的基礎(chǔ)研究評價(jià)指標(biāo)提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物：選取清潔級Sprague-Dawley大鼠20只, 雄性，體重(200±20)g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)合格證號：中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動物中心[SCXK(滬)2008-0016，使用許可證號：SYXK(浙)2013-0184。按照實(shí)驗(yàn)動物合理管理利用等方法[7,8]常規(guī)飼養(yǎng)大鼠， 12 h明暗交替，自主飲食，行為學(xué)檢測時(shí)間控制在9:00至15:00。

1.1.2 主要藥品：角叉菜膠(λ-carrageenan)，美國Sigma 公司生產(chǎn)，批號：1408463V。使用時(shí)，用0.9%生理鹽水配制成2%濃度。

1.1.3 主要儀器：動態(tài)足底測痛儀UGO37450，意大利UGO公司生產(chǎn)；激光多普勒血流儀Pericam PSI，美國Thermo公司生產(chǎn)。以上儀器由浙江中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院針灸神經(jīng)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動物分組及造模：采用SPSS隨機(jī)方法將20只雄性SD大鼠分為正常對照組和模型組，每組10只。模型組大鼠在左后足足跖掌面誘導(dǎo)急性炎性痛模型。具體操作為新鮮配置2%角叉菜膠后，在足跖底部由掌腱膜向踝關(guān)節(jié)方向皮下注射0.1 mL。正常對照組不做處理。造模后4 h檢測大鼠的機(jī)械痛閾和血流灌注量以確定造模是否成功。

1.2.2 機(jī)械痛閾(mechanical withdrawal threshold, MWTs)檢測：采用動態(tài)足底測痛儀引起大鼠壓力痛縮腿反射的閾值作為痛閾指標(biāo)。大鼠于測定基礎(chǔ)痛閾前兩天進(jìn)行適應(yīng)性痛閾檢測，保證測試環(huán)境安靜，室溫25℃，分別于造模前、造模后4 h、24 h、48 h和72 h檢測大鼠患側(cè)足跖機(jī)械痛閾。檢測時(shí)，將大鼠置于塑料板隔開的單獨(dú)空間內(nèi)，底部是鐵制網(wǎng)格結(jié)構(gòu)。安靜30 min后，用針尖對準(zhǔn)位置自動發(fā)力，以2.5 g/s遞增，當(dāng)大鼠自覺疼痛產(chǎn)生縮腿反射時(shí)自動彈開。最大刺激量為50 g，以保證大鼠不受傷害[9,10]。引起大鼠壓力痛縮腿反射的力量記為該次痛閾。每5 min測1次，各測5次，取平均值為機(jī)械痛閾。

1.2.3 血流灌注量(biood parfusion,BP)檢測：采用激光多普勒血流儀檢測各組大鼠患側(cè)足跖皮膚的血流灌注量[11]。每次在MWTs檢測完畢后測定。PSI參數(shù)設(shè)置：波長：781 nm，圖像操作距離監(jiān)測值9.8 cm，監(jiān)測面積1.6 cm×1.6 cm(以掌腱膜中點(diǎn)為中心)，分辨率0.06 mm，3圖片/s。PSI系統(tǒng)采用PIMSoft軟件進(jìn)行記錄保存、讀取分析。PSI可以動態(tài)及時(shí)地反映監(jiān)測部位的血流灌注量并同時(shí)以圖像呈現(xiàn)。PU(perfusion unit)是記錄血流灌注量的單位，PU值越高，血流灌注量越多。大鼠固定后檢測足跖掌面皮膚血流量，血流穩(wěn)定后記錄血流灌注量數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠機(jī)械痛閾變化趨勢

如圖1所示，造模前，兩組大鼠左后足跖MWTs差異均無顯著性；造模后4 h，模型組大鼠MWTs明顯下降，與正常對照組相比差異顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示造模成功；造模后24 h至72 h，模型組大鼠 MWTs較造模后4 h略有上升，但與正常對照組相比仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。

注：與正常對照組相比， ** P<0.01

注：與空白組相比，** P<0.01

表1大鼠患側(cè)機(jī)械痛閾與局部血流灌注量的關(guān)系

Tab.1The relationship between mechanical withdrawal threshold(MWTs) and blood perfusion(BP) in the rats

注： MWTs和BP的Pearson相關(guān)系數(shù)雙尾檢驗(yàn)，**P<0.01

2.2 大鼠局部血流灌注量變化趨勢

如圖2所示，造模前，兩組大鼠左后足跖皮膚BP無明顯差異；造模后4 h，模型組大鼠BP明顯上升，與正常對照組相比差異顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；造模后24 h，模型組大鼠BP下降，與正常對照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；造模后48 h至72 h，模型組大鼠BP又上升，與正常對照組相比差異顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖3中，藍(lán)色至紅色分別代表了BP由少至多的變化(圖3見文后彩插2)。本研究結(jié)果顯示：兩組大鼠患側(cè)足跖BP在不同時(shí)間點(diǎn)呈現(xiàn)動態(tài)變化過程。正常對照組大鼠BP在不同時(shí)間點(diǎn)均呈藍(lán)綠色；造模后4 h至72 h，模型組大鼠BP在造模區(qū)域明顯變成紅色，提示炎癥模型后，局部BP顯著增加。

2.3 大鼠機(jī)械痛閾與血流灌注量的相關(guān)性分析

對大鼠患側(cè)足跖MWTs和BP進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果顯示：大鼠患側(cè)足跖MWTs和BP呈負(fù)相關(guān)(表1)，其中造模后4 h(r=﹣0.615，P=0.007，圖4A)和造模后72 h(r=﹣0.699，P=0.001，圖4B)明顯有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。

圖4 大鼠患側(cè)足跖MWTs和BP的相關(guān)性散點(diǎn)圖(A：造模后4 h；B：造模后72 h)

如圖5所示：分析模型組大鼠患側(cè)足跖MWTs和BP，角叉菜膠造模前，大鼠患側(cè)足跖MWTs和BP無相關(guān)性。造模后，兩者總體呈負(fù)相關(guān)趨勢，在造模后4 h和72 h呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)性(P<0.01)。

注： MWTs和BP的Pearson相關(guān)系數(shù)雙尾檢驗(yàn)，**P<0.01

3 討論

臨床發(fā)現(xiàn)，各種損傷因素導(dǎo)致的組織損傷或壞死常伴隨著急性炎癥的發(fā)生，產(chǎn)生急性炎性痛或病情遷延成慢性炎性痛，嚴(yán)重影響患者的身心健康。因此，對于炎性痛的研究有重要的臨床意義，用動物實(shí)驗(yàn)探討其產(chǎn)生機(jī)制及尋找有效的治療方法亦成為研究熱點(diǎn)。其中，如何測量炎性疼痛對炎性痛研究的順利開展有重要影響。

臨床研究常用的測痛方法主要是VAS評分法。用來作測量的標(biāo)尺標(biāo)有表示“無痛”到“最痛”的固定刻度，由患者根據(jù)目前的疼痛轉(zhuǎn)況，在盲法下判定自我疼痛有幾分，屬于VAS的哪一等級。其他類似的還有提問法、量表法等[9]。其操作均是患者在未知等級分布條件下，自我評價(jià)疼痛指數(shù)。而以實(shí)驗(yàn)動物為主的基礎(chǔ)研究中最常用的測痛方法是機(jī)械測痛[10-12,14]。其原理是觸覺刺激引起足底壓力痛縮腿反射，記錄該次觸覺刺激的力量為痛閾[13]。正常情況下，當(dāng)機(jī)體接收到傷害性刺激信號時(shí)，痛覺傳導(dǎo)通路會將信號傳遞至中樞系統(tǒng)，引起本能的縮腿反射以躲避傷害。當(dāng)病理狀態(tài)下，如炎癥發(fā)生時(shí)，痛覺傳導(dǎo)通路會異常，產(chǎn)生痛覺過敏和痛覺超敏，輕觸即能誘發(fā)縮腿反射以保護(hù)機(jī)體躲避傷害，產(chǎn)生痛閾下降[11, 14]。

由此我們認(rèn)為，基礎(chǔ)研究領(lǐng)域測定炎性痛方式與臨床存在一定差異。由于實(shí)驗(yàn)動物的難溝通性，測痛方法多采用壓力痛等能引起動物本能反射的直接刺激途徑，這可能對正常實(shí)驗(yàn)動物造成一定的傷害。對于炎性痛動物來說，由于痛覺傳導(dǎo)通路異常，本身無傷害性輕觸刺激亦會誘發(fā)疼痛，使其對痛覺更易產(chǎn)生過敏或超敏，從而不可能完全客觀、真實(shí)地反映疼痛本身。臨床測痛中采用的VAS評分法和量表法等，存在一定的主觀因素，但是避免了觸誘發(fā)可能引起的對痛覺程度本身特征的干預(yù)，且更容易被受試者接受。因此，我們認(rèn)為在基礎(chǔ)研究和臨床研究的轉(zhuǎn)化環(huán)節(jié)，尋找能客觀反映疼痛程度又不干預(yù)痛覺發(fā)展過程的疼痛評估方法，實(shí)現(xiàn)動物和人在測痛方式上的統(tǒng)一，將會提高基礎(chǔ)研究的價(jià)值。

角叉菜膠模型是經(jīng)典的局部急性炎癥痛誘發(fā)模型[1-3]。本實(shí)驗(yàn)中，造模大鼠在造模后機(jī)械痛閾明顯下降，造模側(cè)足跖至踝關(guān)節(jié)部腫大發(fā)紅，局部皮膚血流灌注量增加，說明角叉菜膠足底注射誘發(fā)了大鼠疼痛和炎癥的雙重癥狀表現(xiàn)。從模型大鼠機(jī)械痛閾和局部血流灌注量的相關(guān)性分析中我們不難發(fā)現(xiàn)，在造模后4 h，痛閾下降最明顯時(shí)，血流灌注量明顯升高；造模后24 h，痛閾較造模后4 h略上升恢復(fù)，局部血流灌注量亦下降；造模后48 h及72 h，與造模后24 h相比，痛閾有下降趨勢，同期局部血流灌注量上升。這一動態(tài)變化過程充分說明了急性炎癥大鼠中，局部血流量的變化與炎癥導(dǎo)致的疼痛感知密切相關(guān)?，F(xiàn)代研究表明：角叉菜膠致急性疼痛會導(dǎo)致痛覺傳導(dǎo)通路異常，產(chǎn)生痛覺超敏和痛覺過敏，神經(jīng)可塑性增強(qiáng)，誘導(dǎo)局部觸誘發(fā)痛的產(chǎn)生[1,2,15]。同時(shí)，角叉菜膠所致的炎癥會誘發(fā)中性粒細(xì)胞聚集，炎癥介質(zhì)滲出，血管微循環(huán)發(fā)生血液動力學(xué)改變，血管擴(kuò)張，血流加速[16-19]。最新研究表明，傷害性刺激的傳入會引發(fā)脊髓背角的背根反射，而增加皮膚的血流灌注量[20，21]。以上研究結(jié)果提示，角叉菜膠所致的急性疼痛與炎癥引起的血流灌注量增多密切相關(guān)。結(jié)合本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)，通過激光多普勒血流儀監(jiān)測局部皮膚血流灌注量，這一無創(chuàng)傷的便捷模式有希望成為測量急性炎性痛另一方法，并且是在人和實(shí)驗(yàn)動物為觀察對象的研究中都可能被接受的有效方法，有利于炎性痛研究的順利開展。

本研究所選角叉菜膠致急性痛大鼠具有明顯的急性炎癥特征，其在急性痛早期的痛閾與血流變化情況尤顯重要，因此我們有必要在后續(xù)研究中對造模后30 min、1 h、3 h、5 h、7 h、24 h的痛閾血流關(guān)系進(jìn)行系統(tǒng)探討，以確定本模型急性痛早期痛閾與血流的變化特征。另本結(jié)論為動物實(shí)驗(yàn)結(jié)論，是否適用于臨床急性炎性痛研究，還有待驗(yàn)證。

參考文獻(xiàn)：

[ 1 ] Hau VS, Huber JD, Campos CR, et al. Effect of lambda-carrageenan-induced inflammatory pain on brain uptake of codeine and antinociception [J]. Brain Res, 2004, 1018: 257-264.

[ 2 ] Marzocco S, Paola DR, Serraino I, et al. Effect of methylguanidine in carrageenan-induced acute inflammation in the rats [J]. Eur J Pharmacol, 2004, 484: 341-350.

[ 3 ] Fecho K, Manning EL, Maixner W, et al. Effects of carrageenan and morphine on acute inflammation and pain in Lewis and Fischer rats [J]. Brain Behav Immun, 2007, 21:68-78.

[ 4 ] Kima HW, Uha DK, Yoonb SY, et al. Low-frequency electroacupuncture suppresses carrageenan-induced paw inflammation in mice via sympathetic post-ganglionic neurons, while high-frequency EA suppression is mediated by the sympathoadrenal medullary axis [J]. Brain Res Bull, 2008,75: 698-705.

[ 5 ] Kissin I, Freitas CF, Bradley EL. Memory of pain: the effect of perineural resiniferatoxin [J]. Anesth Analg, 2006,103(3): 721-728

[ 6 ] 肖百全, 朱少璇, 楊威, 等. 角叉菜膠致大鼠足腫脹模型探討及其機(jī)制研究 [J]. 中國實(shí)用醫(yī)藥, 2008, 3(23):63-65.

[ 7 ] 徐平. 實(shí)驗(yàn)動物資源開發(fā)、保存和共享利用 [J]. 中國比較醫(yī)學(xué)雜志, 2011, 21(10): 48-56.

[ 8 ] 田還成, 袁慧, 許超琪. 實(shí)驗(yàn)動物墊料的標(biāo)準(zhǔn)化 [J]. 中國比較醫(yī)學(xué)雜志, 2011, 21(10): 72-75

[ 9 ] Liu X, Tian Y, Lu N, et al. Stat3 inhibition attenuates mechanical allodynia through transcriptional regulation of chemokine expression in spinal astrocytes [J]. PLoS ONE, 2013, 8:e75804.

[ 10 ] Barclay J, Patel S, Dorn G, et al. Functional downregulation of P2X3 receptor subunit in rat sensory neurons reveals a significant role in chronic neuropathic and inflammatory pain [J]. J Neurosci, 2002, 22:8139-8147.

[ 11 ] Woolf CJ. Central sensitization: implications for the diagnosis and treatment of pain [J]. Pain, 2011, 152:S2-S15.

[ 12 ] Zhang Z, Liu X, Lu S, et al. Increased pain in response to mechanical or thermal stimulation in a rat model of incision-induced pain with nicotine dependence and withdrawal [J]. Exp Ther Med, 2013, 5: 1063-1066.

[ 13 ] Chaplan SR, Bach FW, Pogrel JW, et al. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw [J]. J Neurosci Methods, 1994, 53: 55-63.

[ 14 ] Ikeda H, Kiritoshi T, Murase K. Contribution of microglia and astrocytes to the central sensitization, inflammatory and neuropathic pain in the juvenile rat [J]. Mol Pain, 2012, 8: 1-10.

[ 15 ] Holthoff JH, Wang Z, Seely KA, et al. Resveratrol improves renal microcirculation, protects the tubular epithelium, and prolongs survival in a mouse model of sepsis-induced acute kidney injury [J]. Kidney Int, 2012, 81: 370-378.

[ 16 ] Dufton N, Hannon R, Brancaleone V, et al. Anti-inflammatory role of the murine formyl-peptide receptor 2: ligand-specific effects on leukocyte responses and experimental inflammation [J]. J immunol, 2010, 184(5): 2611-2619.

[ 17 ] de Melo JO, de Arruda LL, Baroni S, et al. Inhibitory effect of Helicteres gardneriana ethanol extract on acute inflammation [J]. Evid based Complement Alternat Med: 2012, 2012:1-5.

[ 18 ] Wei H, Saarnilehto M, Falck L, et al. Spinal transient receptor potential ankyrin 1 channel induces mechanical hypersensitivity, increases cutaneous blood flow, and mediates the pronociceptive action of dynorphin A [J]. J Physiol Pharmacol, 2013, 64:331-340.

[ 19 ] Lin Q, Li D, Xu X, et al. Roles of TRPV1 and neuropeptidergic receptors in dorsal root reflex-mediated neurogenic inflammation induced by intradermal injection of capsaicin [J]. Mol Pain, 2007, 3:1-14.

[ 20 ] Hagains CE, Trevino LA, He JW, et al. Contributions of dorsal root reflex and axonal reflex to formalin-induced inflammation [J]. Brain rRes, 2010, 1359: 90-97.

[ 21 ] Lin Q, Wu J, Willis WD. Dorsal root reflexes and cutaneous neurogenic inflammation after intradermal injection of capsaicin in rats [J]. J Neurophysiol, 1999, 82: 2602-2611.