韓凱凱+李銀+黃欣梅+等

摘要：以鵝坦布蘇病毒（goose Tembusu virus，GTMUV）的囊膜蛋白基因序列為基礎，采用Chou-Fasman法、Garnier-Robson法和Karplus-Schulz法預測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，采用Kyte-Doolittle方案、Emini方案和Jameson-Wolf方案預測鵝坦布蘇病毒囊膜蛋白的B細胞表位。結(jié)果表明，鵝坦布蘇病毒囊膜蛋白肽鏈的35～41、80～89、148～159、245～251、314～320、392～402和475～482區(qū)段為預測的B細胞表位優(yōu)勢區(qū)。綜合研究結(jié)果，利用多參數(shù)方案綜合預測E蛋白的B細胞抗原表位為進一步鑒定表位及設計疫苗奠定了基礎。

關鍵詞：坦布蘇病毒；囊膜蛋白；二級結(jié)構(gòu)；B細胞表位

中圖分類號： S858.335.3文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）06-0166-03

收稿日期：2013-09-13

基金項目：國家自然科學基金（編號：31172345）；江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金[編號：CX（12）5048]。

作者簡介：韓凱凱（1983—），男，河南新鄉(xiāng)人，博士，助理研究員，主要從事家禽病毒分子生物學研究。E-mail：hankk0917@126.com。

通信作者：李銀，博士，研究員，主要從事家禽疫病流行病學和防治相關的研究。E-mail：muziyin08@163.com。2010年春季以來，上海、浙江、江蘇等地相繼暴發(fā)了一種導致鴨鵝產(chǎn)蛋量急劇下降的新發(fā)疾病，發(fā)病鴨鵝主要表現(xiàn)為高熱、運動障礙、食欲下降甚至廢絕、產(chǎn)蛋下降甚至停止，死亡率可達 5%～10%[1]。其典型病理變化表現(xiàn)為鴨鵝的卵巢先發(fā)生出血、萎縮、破裂，患病后期出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，倒地震顫，最終衰竭死亡。該病傳播迅速、波及面廣，幾乎席卷了整個水禽養(yǎng)殖密集地區(qū)，給我國鴨鵝養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大損失[2]。目前已證實，引起該病的病原為坦布蘇病毒（Tembusu virus，TMUV）[3]。坦布蘇病毒屬于黃病毒科（Flaviviridae）不分節(jié)段的單股正鏈 RNA 病毒，含有單一的開放讀碼框，編碼 結(jié) 構(gòu) 蛋 白（C、 PrM、E）和 非 結(jié) 構(gòu) 蛋 白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5），其中E蛋白是坦布蘇病毒的囊膜蛋白，由 500個氨基酸組成，在病毒的吸附、融合、細胞趨向性、病毒毒力和誘導保護性免疫反應中起重要作用[4]。測定E蛋白的晶體結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，它在空間上可以形成3個不同的結(jié)構(gòu)域（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ區(qū)）。在乙型腦炎病毒E蛋白抗原表位研究中，Kolaskar等認為，E蛋白的三維結(jié)構(gòu)域Ⅲ（292～402 aa）集中許多抗原中和表位[5]。Seif等通過分段表達E蛋白，證明了中和表位存在于 E373-399位的27個氨基酸序列內(nèi)[6]。Wu等研究發(fā)現(xiàn)，JEV的中和位點主要集中在EⅢ的E307-309、E327-333、E386-390這3個區(qū)域內(nèi)[7]。由于該病毒的發(fā)現(xiàn)時間不長，其主要蛋白抗原表位研究尚未見報道。有學者提出，蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)、親水性、柔韌性、抗原性、表面可及性等特性與B細胞抗原的表位分布存在密切聯(lián)系[8]。本試驗首次應用生物信息技術(shù)對鵝坦布蘇病毒（goose Tembusu virus，GTMUV）E蛋白基因推導的肽鏈進行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)和B細胞表位的預測分析，旨在為坦布蘇病毒E蛋白功能的研究、抗體的制備及分子疫苗的設計等提供理論基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

預測所使用的坦布蘇病毒毒株來自鵝源JS804株，其病毒開放閱讀框氨基酸序列由筆者所在實驗室測定，共有500個氨基酸殘基，GeneBank登錄號為JF895923。

1.2試驗方法

先用單參數(shù)對毒株E蛋白的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)進行預測，再采用不同的參數(shù)對E蛋白的二級結(jié)構(gòu)及B細胞表位進行綜合預測和分析。

1.2.1GTMUV E蛋白二級結(jié)構(gòu)預測應用DNAStar軟件的protean模塊進行二級結(jié)構(gòu)預測。采用Chou-Fasman法從氨基酸殘基的晶體結(jié)構(gòu)來預測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)；用Garnier-Robson法計算特定氨基酸殘基在特定結(jié)構(gòu)內(nèi)部的可能性；用Karplus-Schultz法預測蛋白質(zhì)骨架區(qū)的柔韌性。其中各參數(shù)的意義見相關文獻[9-10]。

1.2.2GTMUV E蛋白B細胞抗原表位預測用DNA Star軟件Protean程序預測B細胞抗原表位；用Kyte-Doolittle方法，同時依據(jù)氨基酸組成預測蛋白的親水區(qū)和疏水區(qū)；用Emini方法預測特定區(qū)域于蛋白質(zhì)表面的可及性；用Jameson-Wolf法預測蛋白的抗原指數(shù)，同時根據(jù)http：//tools.immuneepitope.org/tools/bcell/iedb_input網(wǎng)址中的Kolaskar-Tongaonkar法預測蛋白的平均抗原表位指數(shù)。結(jié)合蛋白的親水性、表面可及性、柔韌性、抗原指數(shù)等對測定結(jié)果進行綜合分析。綜合預測結(jié)果，預測鵝坦布蘇病毒E蛋白的潛在優(yōu)勢B細胞抗原表位，其中各參數(shù)的意義參考相關文獻[11-13]。

2結(jié)果與分析

2.1GTMUV E蛋白的氨基酸序列

鵝坦布蘇病毒E蛋白基因編碼500個氨基酸，其理論分子量為54.38 kDa，理論等電點pI為7.32，存在跨膜區(qū)域。通過http：//prosite.expasy.org/scanprosite/在線服務器預測表明，該蛋白有N_糖基化位點、蛋白激酶C磷酸化位點、酪蛋白激酶II磷酸化位點和N-豆蔻酰化位點。

2.2GTMUV E蛋白二級結(jié)構(gòu)的預測

采用DNAStar軟件的Chou-Fasman法、Garnier-Robson法以及Karplus-Schultz法對E蛋白的二級結(jié)構(gòu)進行預測，結(jié)果見圖1。

Garnier-Robson法預測結(jié)果顯示，E蛋白有14個α-螺旋，32個β-折疊區(qū)域。Chou-Fasman法預測結(jié)果顯示，E蛋白有16個α-螺旋，23個β-折疊區(qū)域。2種方法預測出的α-螺旋均較β-折疊數(shù)量少；2種方法預測的α-螺旋共有12個，分別位于41～57、79～81、87～92、117～120、133～144、157～165、179～181、239～252、261～267、285～296、412～417、468～478區(qū)段上；2種方法預測的β-折疊區(qū)域共有20個，分別位于1～4、20～25、31～36、62～38、166～170、186～189、201～205、270～274、299～302、310～314、322～328、338～341、254～359、381～386、391～397、423～425、435～438、443～448、482～486、491～496區(qū)段上。同時發(fā)現(xiàn)，Garnier-Robson法預測的β-轉(zhuǎn)角區(qū)域遠遠少于Chou-Fasman法，Gamier-Robson法預測的無規(guī)則卷曲分布區(qū)段相對集中，主要位于15～17、145～148、226～239、456～461區(qū)段上。

2.3柔韌性區(qū)域分析

利用Karplus-Schultz法預測E蛋白骨架區(qū)的柔韌性，由結(jié)果可知，E蛋白骨架區(qū)含有分布較均勻的柔韌性區(qū)域，肽鏈中具有較高表面可及性的區(qū)域主要在62～78、92～104、225～239、273～286、313～322、362～370和399～416區(qū)段上（圖2）。由于這些蛋白肽段的柔韌性較大，發(fā)生扭曲、折疊的概率較高，因此形成表位的可能性較大，容易與抗體進行嵌合。

2.4E蛋白的B細胞抗原表位預測分析

2.4.1E蛋白的親水性預測分析利用Kyte-Doolittle方法預測E蛋白的親水性，結(jié)果顯示，E蛋白具有較高的親水性，親水性區(qū)域的分布較均勻，主要分布在E蛋白肽鏈的36～45、60～104、119～137、147～165、174～199、207～251、275～309、310～320、391～405和475～483區(qū)段上（圖3）。B細胞抗原表位多位于蛋白外側(cè)，而親水氨基酸殘基多位于蛋白表面，因此該區(qū)段位于蛋白表面的可能性最大，作為抗原表位的概率也最高。

2.4.2E蛋白的表面可及性預測分析利用Emini方法進行E蛋白的表面可及性分析，結(jié)果表明，E蛋白肽鏈中具有較高表面可及性的區(qū)域在7～12、34～41、80～89、123～126、130～136、148～163、233～239、245～250、315～319、392～402和476～481區(qū)段上（圖4）。由于這些區(qū)域可能位于蛋白分子表面，因此有可能形成表位。

2.4.3E蛋白的抗原指數(shù)及抗原表位指數(shù)預測分析應用DNAStar軟件，采用Jameson-Wolf方法對E蛋白的抗原性進行預測。從圖5的分析可見，E蛋白存在有多個潛在的抗原表位位點，具有較高抗原指數(shù)的區(qū)域在6～19、26～31、33～44、61～89、92～105、108～115、118～137、144～159、172～177、179～186、189～199、226～251、257～262、273～301、312～322、330～339、344～355、376～383、388～395、397～418和475～484區(qū)段上。Kolaskar-Tongaonkar法預測的E蛋白平均抗原表位指數(shù)為1. 027，詳見圖6。

2.5E蛋白B細胞抗原表位綜合預測

通過對鵝坦布蘇病毒E蛋白的二級結(jié)構(gòu)、親水性、柔韌性、抗原指數(shù)、表面可及性等參數(shù)分析顯示，若抗原表位指數(shù)≥1.027，親水性指數(shù)≥0，氨基酸的抗原表位可及性指數(shù)≥1，且區(qū)段內(nèi)部或附近具有柔韌性結(jié)構(gòu)，則這一區(qū)段為抗原表位的可能性較大。按照如上方法篩選表明，在E蛋白肽鏈的第35～41、80～89、148～159、245～251、314～320、392～402和475～482區(qū)段上，各種方案預測的結(jié)果基本一致，且在蛋白二級結(jié)構(gòu)上含有較易形成抗原表位的轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)。因此可以推測，E蛋白的B細胞抗原表位可能在以上區(qū)域內(nèi)或附近。

3結(jié)論與討論

B細胞識別蛋白抗原時，是以其表面的B細胞抗原受體（BCR）與蛋白抗原表位結(jié)合，此過程與抗原抗體的結(jié)合類似。作為B細胞的抗原表位，應位于或易于移動到蛋白抗原表面，有利于與B細胞抗原受體或抗體結(jié)合；同時還要有一定柔韌性，因為抗原與抗原受體或抗體的結(jié)合是一個相互嵌合的過程。因此，預測B細胞抗原表位時主要從蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)、柔韌性、表面可及性和親水性等幾個方面入手。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)與表位分布關系密切，在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中作為骨架起穩(wěn)定作用的主要是α-螺旋和β-折疊，而決定蛋白質(zhì)功能與抗原表位分布的則多是β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲[14]。

由于螺旋區(qū)段和折疊區(qū)段的化學鍵能較高，主要維持蛋白的高級結(jié)構(gòu)，且經(jīng)常位于蛋白質(zhì)內(nèi)部，很難較好地與抗體嵌合，不易形成抗原表位；而轉(zhuǎn)角區(qū)域和無規(guī)則卷曲區(qū)域的結(jié)構(gòu)是比較松散的結(jié)構(gòu)，易于發(fā)生扭曲、盤旋，并多位于蛋白質(zhì)分子表面，有利于與抗體嵌合，成為抗原表位的可能性較大。蛋白質(zhì)的柔韌性是指蛋白抗原構(gòu)象不是剛性不變的，其多肽骨架有一定程度的活動性；親水性分析結(jié)合二級結(jié)構(gòu)預測已被廣泛應用于抗原表位分析[15]。

本研究采用Chou-Fasman法和Garnier-Robson法預測鵝坦布蘇病毒蛋白的二級結(jié)構(gòu)，利用Karplus-Schulz法預測其柔性區(qū)域，利用Kyte-Doolittle方法預測E蛋白的親水區(qū)和疏水區(qū)。結(jié)果顯示，鵝坦布蘇病毒E蛋白的二級結(jié)構(gòu)較為復雜，且α-螺旋和β-折疊分布相對均勻，含有較多的轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲等柔性區(qū)域，這些柔性區(qū)域的存在為抗原表位的確定提供了有力的證據(jù)。同時，與這些區(qū)域相對應的親水性、柔韌性、抗原指數(shù)和表面可及性等參數(shù)也較高，因此預測這些區(qū)段應是潛在優(yōu)勢B細胞抗原表位所在區(qū)段。需要注意的是，一個蛋白質(zhì)中某段氨基酸序列能否誘導體內(nèi)產(chǎn)生抗體是多種復雜因素共同作用的結(jié)果。B細胞抗原表位，尤其是其構(gòu)象表位，主要是通過三維立體結(jié)構(gòu)來展現(xiàn)其抗原性，而生物信息學分析軟件主要是對其二級結(jié)構(gòu)進行預測，因此用于預測構(gòu)象依賴型表位有一定的局限性。本試驗的預測結(jié)果只能作為鑒定鵝坦布蘇病毒E蛋白潛在表位的參考，預測結(jié)果正確與否還有待于科學研究證實。即便如此，通過生物信息學的方法對E蛋白進行預測，不僅可以了解坦布蘇病毒E蛋白抗原的結(jié)構(gòu)、功能、抗原抗體反應等有關免疫反應的諸多信息，而且對診斷試劑研發(fā)、藥物制備和核酸疫苗設計等也具有指導意義。

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