封洲燕 余 穎 曹嘉悅 郭哲杉

(浙江大學生物醫(yī)學工程與儀器科學學院 生物醫(yī)學工程教育部重點實驗室，杭州 310027)

大鼠海馬神經(jīng)元群體對于高頻電刺激的響應

封洲燕*余 穎 曹嘉悅 郭哲杉

(浙江大學生物醫(yī)學工程與儀器科學學院 生物醫(yī)學工程教育部重點實驗室，杭州 310027)

腦深部電刺激(DBS)在帕金森和癲癇等疾病治療中的應用不斷發(fā)展，但DBS對于神經(jīng)元的作用機制尚無定論。為了研究DBS對于大腦神經(jīng)網(wǎng)絡的作用，在麻醉大鼠海馬CA1區(qū)的輸入和輸出軸突纖維上，分別施加正向和反向高頻電刺激(HFS)，考察CA1區(qū)錐體神經(jīng)元的同步動作電位(即群峰電位)發(fā)放情況。結(jié)果表明，50 Hz的正向HFS可以誘發(fā)持續(xù)發(fā)放的群峰電位，而100和200 Hz的正向HFS誘發(fā)的群峰電位卻要少得多。在不同頻率的反向HFS中，每個刺激脈沖均誘發(fā)群峰電位，但它們的幅值逐漸減?。欢?，刺激頻率越高，幅值減小得越快?？梢姡饔糜谳S突的HFS對于上游和下游神經(jīng)元群體都具有興奮作用，但頻率越高，興奮作用越小。這些結(jié)果，對于深入了解DBS的作用機制以及安全有效地推廣其臨床應用都具有重要的意義。

大腦深部電刺激；高頻電刺激；海馬；群峰電位；神經(jīng)網(wǎng)絡

引言

深部腦電刺激(deep brain stimulations，DBS)在臨床上已成功用于治療帕金森氏癥，它對于癲癇、成癮和抑郁癥等其他許多腦疾病的治療作用，也受到越來越多的關(guān)注[1-3]。DBS通常使用高于100 Hz的電脈沖刺激，因此，也被稱為高頻刺激(high frequency stimulation，HFS)。例如，能夠有效控制帕金森患者顫抖的DBS刺激頻率為130 Hz；控制癲癇發(fā)作，也是時長1～3 min的100 Hz以上的電刺激[4-5]。但另一方面，動物實驗中也常用短促的HFS誘發(fā)腦組織產(chǎn)生癇樣發(fā)放[6-7]。那么，在長時間的HFS刺激期間，腦組織的刺激作用靶點是否會經(jīng)歷強烈的動作電位發(fā)放活動？利用HFS治療癲癇是一種“以毒攻毒”的作用嗎[8]？HFS的刺激頻率對于DBS的作用影響如何？這些問題尚無明確的解答[9]。本研究利用麻醉大鼠大腦海馬區(qū)的HFS實驗來研究這些問題。

由于大腦神經(jīng)元之間通過軸突的傳導和突觸的連接形成復雜的神經(jīng)網(wǎng)絡，外界施加的HFS會同時作用于刺激位點的上游和下游神經(jīng)元群體。因此，為了揭示HFS的作用機制，本研究在海馬CA1區(qū)分別施加正向和反向的高頻電刺激，通過分析細胞外記錄的誘發(fā)電位，比較50、100和200 Hz不同頻率HFS刺激期間，CA1區(qū)神經(jīng)元群體作為刺激下游和上游時的不同反應。結(jié)果表明，HFS的頻率越高，刺激期間所誘發(fā)的神經(jīng)元動作電位發(fā)放越少。這些實驗結(jié)果，對于安全有效地實施HFS的臨床應用具有重要的參考價值。

1 材料與方法

1.1動物手術(shù)與電極植入

成年Sprague-Dawley大鼠26只(體重250～300 g，購自浙江省實驗動物中心)，用烏拉坦(Urethane)1.25 g/kg腹腔注射麻醉后，固定于大鼠腦立體定位儀上，切開頭部皮膚，除去部分顱骨，再放置電極。

記錄電極為美國NeuroNexus Technologies公司生產(chǎn)的16通道微電極陣列，植入至海馬CA1區(qū)，定位是前囟后3.5 mm，旁開2.7 mm，大腦皮層表面向下深2.5～3.0 mm。刺激電極使用FHC公司的同芯雙極不銹鋼電極。其中，正向刺激電極植入至CA1區(qū)的輸入通路Schaffer側(cè)支，定位是前囟后2.2 mm，旁開2.0 mm，深約2.8 mm[10]；反向刺激電極植入至CA1區(qū)的輸出通路(即軸突纖維Alveus)上，定位是前囟后4.8 mm，旁開2.7 mm，深2.0～2.5 mm。此外，固定于鼻骨上的兩顆小螺釘，分別作為參考電極和接地電極。

1.2記錄與刺激

記錄電極采集的電信號，經(jīng)過3600型細胞外放大器(A-M Systems Inc.美國)放大之后，用PowerLab ML880 16/30型多通道信號采集系統(tǒng)(ADInstruments，Pty Ltd，澳大利亞)，以20 kHz的頻率采樣(A/D轉(zhuǎn)換分辨率為16位)，數(shù)據(jù)存入硬盤，用于離線分析。放大器的頻率范圍設定為0.3 Hz ～ 5 kHz，放大倍數(shù)為100。

刺激信號是脈寬為0.1 ms的雙相恒流脈沖，由2100型刺激器(A-M Systems Inc.美國)產(chǎn)生。HFS的刺激頻率設為3種：50、100、200 Hz；刺激持續(xù)時間為5 s或者1～4 min；刺激強度設為能夠誘發(fā)出最大群峰電位(population spike，PS)幅值的75%的電流值，約為0.3～0.5 mA。每只大鼠實驗中，不同頻率HFS串的實施順序隨機安排，且每串HFS之間約間隔半小時，以避免各HFS之間的相互影響。

1.3信號分析

為了考察HFS期間誘發(fā)電位的變化情況，利用自行編寫的Matlab程序自動識別刺激偽跡和PS波。去除刺激偽跡，并計算PS波的幅值和潛伏期(即PS負峰與其之前刺激偽跡之間的時間差)。算法詳見文獻[11]。

PS波是細胞外記錄的神經(jīng)元群體同步發(fā)放的動作電位整合信號。所涉及的PS波有兩種：一是正向或者反向刺激直接誘發(fā)的PS波，它與刺激脈沖之間存在特定的潛伏期關(guān)系，潛伏期取決于軸突、突觸和樹突等的傳導速度；二是神經(jīng)元處于過度興奮狀態(tài)時自發(fā)產(chǎn)生的PS波，也就是癇樣棘波，在HFS期間這種棘波與刺激之間沒有特定的時間關(guān)系，它們與刺激脈沖不同步。

實驗數(shù)據(jù)均表示為均值±標準差，并采用單因素方差分析(ANOVA)和Post hoc Bonferroni兩兩比較法，來判斷多組數(shù)據(jù)之間的差別是否具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1海馬CA1區(qū)神經(jīng)元對于正向電刺激的響應

如圖1所示，通過置于海馬CA1區(qū)Schaffer側(cè)支上的正向刺激電極，可以在CA1區(qū)錐體神經(jīng)元的胞體層誘發(fā)出正向群峰電位(orthodromically-evoked population spike，OPS)。對于電流強度相同的雙脈沖刺激，如果兩個脈沖之間的間隔足夠短，比如圖1(b)所示的50 ms。那么，第一個刺激能夠誘發(fā)出大幅值的OPS1，而第二個刺激卻不能誘發(fā)明顯的群峰電位，即OPS2很小。這是CA1區(qū)中間神經(jīng)元抑制回路作用的結(jié)果[12]。那么，在連續(xù)的脈沖串刺激下神經(jīng)元的反應會怎樣呢？

圖1(c)的第一行所示，是刺激強度為0.3 mA的5 s短促100 Hz正向串刺激作用下CA1區(qū)神經(jīng)元的響應?？梢?，刺激結(jié)束后，大幅值PS波組成的癇樣發(fā)放仍然持續(xù)了的4.5 s。從去除刺激偽跡的信號(圖1(c)的第二和第三行)可見：第一個刺激誘發(fā)的大幅值OPS1之后，約90 ms時間內(nèi)沒有出現(xiàn)大的PS波。之后，重新出現(xiàn)PS波時，它們與刺激的節(jié)律不再同步，發(fā)放形式與癇樣棘波相似[6]。圖1(c)和后續(xù)圖中記錄信號上方的橫杠表示刺激持續(xù)時間；倒箭頭和虛線表示去除的刺激偽跡。

前人的研究已證明，在重復的刺激作用下中間神經(jīng)元所產(chǎn)生的抑制作用會減小[13-14]。因此，癇樣棘波的出現(xiàn)可能是抑制回路作用減弱的結(jié)果。那么，延長串刺激的時間是否會誘發(fā)更多的癇樣發(fā)放呢？

圖1 海馬CA1區(qū)神經(jīng)回路及其正向電刺激響應。(a)神經(jīng)回路示意圖以及記錄電極和正向刺激電極的置位；(b)雙脈沖正向刺激誘發(fā)的群峰電位；(c)長5 s的100 Hz正向串刺激誘發(fā)的電位Fig.1 Neural networks and orthodromically-evoked responses of hippocampal CA1 region. (a) Schematic diagram of the neural networks and the placements of recording electrode and orthodromic-stimulation electrode; (b) PS waveforms evoked by a paired-pulse orthodromic-stimulation; (c) Evoked potentials induced by a train of 5 s 100 Hz orthodromic stimuli

圖2所展示的持續(xù)4 min的100 Hz正向HFS刺激中，起始約10 s內(nèi)的電位變化與圖1(c)相似，存在大幅值誘發(fā)電位和癇樣棘波；然后，在>3 min的時間內(nèi)幾乎沒有明顯的棘波；最后，鄰近HFS結(jié)束時，出現(xiàn)零星棘波(見右下角的放大圖)。HFS結(jié)束后沒有跟出棘波發(fā)放。

在HFS剛結(jié)束時，單脈沖的測試刺激不能誘發(fā)明顯的OPS(見圖2中刺激后30 s時的誘發(fā)電位)；然后OPS逐漸恢復；直至HFS后約3 min，誘發(fā)的OPS幅值恢復至與HFS前相似。由此可見，持續(xù)的100 Hz高頻刺激不會誘發(fā)強烈的神經(jīng)元群體發(fā)放。接下來考察了更低的50 Hz和更高的200 Hz持續(xù)HFS刺激期間的神經(jīng)元響應情況。

圖2 長時間100 Hz正向HFS刺激作用下海馬CA1區(qū)胞體層的響應電位Fig.2 Response potentials recorded in the pyramidal layer of hippocampal CA1 region under a long period of 100 Hz orthodromic HFS

2.2不同頻率持續(xù)正向HFS刺激的作用

如圖3(a)所示，在50 Hz的1 min正向HFS刺激期間，CA1區(qū)幾乎始終存在棘波。從放大圖中可見，第一個刺激誘發(fā)的OPS1之后的抑制期仍然存在，約100 ms之后重新出現(xiàn)棘波，并一直持續(xù)至HFS結(jié)束。圖3(b)所示的200 Hz的1min刺激期間卻只有起始的約0.3 s內(nèi)存在棘波，往后再沒有出現(xiàn)明顯的棘波。

50、100和200 Hz這3種不同頻率的HFS實驗統(tǒng)計數(shù)據(jù)如表1所示。將HFS期間的各個棘波幅值除以OPS1的幅值，計算不同刺激頻率下1 min正向HFS期間的歸一化棘波幅值總和，結(jié)果見表1最后一列?？梢?，刺激頻率越高，HFS期間誘發(fā)的棘波就越少。50 Hz正向HFS期間棘波含量遠多于100和200 Hz的HFS，它們的差別具有顯著的統(tǒng)計學意義。

表1 時長1 min的不同頻率正向和反向HFS刺激期間PS活動強度的比較

a正向HFS和反向HFS的不同頻率組之間ANOVA檢驗結(jié)果為：F>8.7,P<0.01;

*100或200 Hz組與50 Hz組比較，Post hoc Bonferroni的檢驗結(jié)果為P<0.01.

圖3 時長1 min的50 Hz(a)和200 Hz(b)正向HFS期間CA1區(qū)胞體層的響應電位Fig.3 Response potentials recorded in the pyramidal layer of hippocampal CA1 region under 1 min long 50 Hz (a) and 200 Hz (b) orthodromic HFS

正向刺激作用于CA1區(qū)神經(jīng)元輸入通路的突觸前軸突纖維上，此時CA1區(qū)是刺激的下游。上述研究結(jié)果表明，在同樣的1 min內(nèi)，雖然頻率較高的100和200 Hz的HFS中所包含的刺激脈沖數(shù)量更多，但它們在下游神經(jīng)元群體中誘發(fā)的動作電位發(fā)放量，卻遠比50 Hz的HFS要少得多。這說明刺激頻率越高，HFS對于下游神經(jīng)元的興奮作用越小。

2.3不同頻率持續(xù)反向HFS刺激的作用

神經(jīng)元的軸突就像電纜線，具有雙向傳導特性，既可以將刺激誘發(fā)的興奮傳向下游，也可以將興奮傳向上游，直達胞體部位，也就是所謂的反向傳導。那么，HFS對于上游神經(jīng)元的作用又如何呢？為了便于比較，仍然記錄CA1區(qū)胞體層的神經(jīng)元響應，而將電刺激的位置移至CA1區(qū)的輸出軸突纖維(即alveus)上，這樣，CA1區(qū)就成為刺激的上游。

如圖4(a)所示，Alveus纖維上的反向刺激在CA1區(qū)錐體神經(jīng)元的胞體層誘發(fā)出反向群峰電位(Antidromically-evoked population spike，APS)。并且，對于閾上刺激強度，雙脈沖刺激可以誘發(fā)出幅值相似的2個APS(見圖4(b))。這是因為興奮沿著自身軸突傳導至胞體時不受抑制回路的影響[12]。而且，與圖1(a)所示的正向刺激不同，5 s短促的100 Hz反向HFS刺激結(jié)束之后沒有癇樣發(fā)放(圖4(c))。但是，從放大圖中可見，在HFS期間，每個脈沖都能夠誘發(fā)出APS，只是后期APS的幅值明顯減小。

圖5所示是1 min的持續(xù)50、100和200 Hz反向HFS期間誘發(fā)的APS的變化過程。圖中第1行是去刺激偽跡之后的誘發(fā)信號，第二、三行分別是HFS期間每個刺激脈沖誘發(fā)的APS幅值和潛伏期的散點圖?？梢?，反向HFS期間的APS幅值和潛伏期的變化很有規(guī)律。3種不同頻率的HFS期間APS的幅值都減小而潛伏期增大。并且，刺激頻率越高，變化速度越快。在1 min刺激期間，較低的50 Hz頻率下，APS的2個指標都持續(xù)變化，沒有出現(xiàn)明顯的穩(wěn)定期；而較高的100和200 Hz頻率下，經(jīng)過最初的數(shù)秒刺激之后，APS的幅值和潛伏期就基本穩(wěn)定。

刺激時長相同時，頻率較高的反向HFS期間所誘發(fā)的APS個數(shù)較多，100和200 Hz的APS個數(shù)分別為50 Hz的2倍和4倍。但是，神經(jīng)元動作電位發(fā)放的強度還與APS的幅值相關(guān)(Théorêt,1984)。將HFS期間的各個棘波幅值除以APS1的幅值，計算不同刺激頻率下1 min反向HFS期間的歸一化APS幅值總和，結(jié)果如表1所示。可見，雖然50 Hz反向HFS期間APS的個數(shù)較少，但其幅值總和還是大于100和200 Hz的HFS，它們的差別具有顯著的統(tǒng)計學意義。這表明刺激頻率越高，HFS對于上游神經(jīng)元群體的興奮作用也越小。

圖4 海馬CA1區(qū)對于反向電刺激的響應。(a)記錄電極和反向刺激電極位置示意圖；(b)反向雙脈沖刺激誘發(fā)的群峰電位；(c)長5 s的100 Hz反向串刺激誘發(fā)的電位Fig.4 Antidromically-evoked responses of hippocampal CA1 region. (a) Schematic diagram of the placements of recording electrode and antidromic-stimulation electrode; (b) PS waveforms evoked by a paired-pulse antidromic-stimulation; (c) Evoked potentials induced by a train of 5 s 100 Hz antidromic stimuli

3 討論

大腦神經(jīng)元之間，通過軸突連接成復雜的神經(jīng)網(wǎng)絡，任何部位的DBS都可能刺激到軸突纖維，從而作用于上游和下游神經(jīng)元群體。本研究的重要發(fā)現(xiàn)是：在1 min時長的HFS期間，上游和下游神經(jīng)元的響應有所不同，當刺激頻率高于100 Hz時，除了起始的數(shù)秒時間以外，下游神經(jīng)元并不產(chǎn)生強烈的動作電位發(fā)放；上游神經(jīng)元雖然能夠響應每個刺激脈沖，但是，其群峰電位的幅值迅速減小，表明發(fā)放的神經(jīng)元數(shù)量迅速減少[15]?？梢姡琀FS的頻率越高，刺激期間神經(jīng)元發(fā)放的強度越小。這些現(xiàn)象的可能機制分析如下。

在正向HFS期間，不同頻率的刺激所產(chǎn)生的作用差別很大：50 Hz較低頻率的刺激，會誘發(fā)海馬CA1區(qū)產(chǎn)生持續(xù)的癇樣發(fā)放，而100和200 Hz誘發(fā)的癇樣發(fā)放則少得多。但是，在HFS的初期，CA1區(qū)神經(jīng)元的響應都很相似，第一個大幅值OPS之后緊跟一段幾乎無誘發(fā)波的時期，然后重新出現(xiàn)棘波(見圖2和圖3)。誘發(fā)波缺失的這一階段，可能是GABA能抑制性中間神經(jīng)元的作用結(jié)果。HFS的脈沖同時激活了中間神經(jīng)元，從而通過前饋和反饋回路抑制了CA1區(qū)的錐體神經(jīng)元[12,16-18]。不過，前人的研究工作已證明，在高頻刺激的反復作用下GABA能的抑制會迅速減退[13, 19]，這就是癇樣棘波后來又會重新出現(xiàn)的原因。那么，為什么50 Hz的HFS期間癇樣發(fā)放能夠持續(xù)，而100 Hz以上較高頻率的HFS期間癇樣發(fā)放卻比較少呢？

當HFS的刺激脈沖施加在CA1區(qū)的輸入通道Schaffer側(cè)支的軸突纖維上時，會誘發(fā)軸突在刺激位點處產(chǎn)生動作電位，然后延軸突傳導下去。當刺激頻率過高時，由于軸突響應速度的限制，刺激位點不能跟隨每個刺激脈沖產(chǎn)生動作電位；或者，即使刺激位點產(chǎn)生了動作電位，也不是每個動作電位都能夠沿軸突順利傳導至末梢。當然，還有一種可能是，軸突能夠順利響應并傳導高頻率的動作電位發(fā)放，但是軸突末梢的突觸傳導速度存在限制，無法產(chǎn)生高頻響應。不過，已有的研究結(jié)果表明，響應速度的限制早在突觸前的軸突上就已發(fā)生[20-22]。數(shù)學模型的仿真結(jié)果也表明HFS可以阻止軸突的傳導[23]。

據(jù)此可以推測，Schaffer軸突纖維可以有效地響應并傳導50 Hz的興奮作用，從而能夠誘發(fā)下游神經(jīng)元群體持續(xù)產(chǎn)生癇樣發(fā)放；但它無法有效地響應高于100Hz的刺激脈沖。

CA1區(qū)神經(jīng)元對于反向HFS的響應也反映了高頻刺激使軸突傳導受阻的機制。神經(jīng)元的軸突具有雙向傳導特性，在CA1區(qū)輸出軸突上施加刺激所誘發(fā)的興奮可以反向傳導至胞體。但是，當HFS的頻率高于100 Hz時，HFS期間誘發(fā)的APS幅值迅速減小，并且APS的潛伏期增大，表明軸突傳導出現(xiàn)障礙，其興奮的產(chǎn)生和傳導速度跟不上刺激頻率。當然，反向誘發(fā)APS波的減小也可能是神經(jīng)元胞體興奮性降低所致，但已有的研究結(jié)果表明，HFS期間胞體仍然保持較高的興奮性[10]。因此，可以排除這種可能性。

此外，本研究是在麻醉狀態(tài)下進行的，所使用的麻醉劑烏拉坦常用于小動物的神經(jīng)系統(tǒng)實驗。在正常的手術(shù)劑量下，它對于神經(jīng)元的動作電位發(fā)放率僅有較小的抑制作用，而對于興奮性和抑制性突觸的傳導幾乎沒有影響[24]。因此，本文的研究結(jié)果不會受到烏拉坦麻醉的明顯影響。當然，清醒狀態(tài)下進一步的研究，可以提供更深入的DBS信息。

4 結(jié)論

本研究的結(jié)果表明，大腦深部電刺激雖然對于神經(jīng)元具有興奮作用，但當刺激頻率高于100 Hz時，它誘發(fā)的神經(jīng)元同步動作電位發(fā)放會極大地減少；而且對于刺激位點的上游和下游神經(jīng)元群體都是如此。這些結(jié)果對于深入了解DBS的作用機制以及安全有效地推廣DBS的應用都具有重要的意義。

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ResponseofNeuronalPopulationtoHighFrequencyElectricalStimulationinRatHippocampus

FENG Zhou-Yan*YU Ying CAO Jia-Yue GUO Zhe-Shan

(CollegeofBiomedicalEngineeringandInstrumentationScience,KeyLaboratoryofBiomedicalEngineeringofNationalEducationMinistry,ZhejiangUniversity,Hangzhou310027,China)

Deep brain stimulations (DBS) have been developed for treating brain diseases such as Parkinson’s disease and epilepsy. But the mechanisms underlying DBS are not clear yet. In order to study the effects of DBS on the neural networks of brain, both orthodromic- and antidromic-high frequency stimulation (HFS) were respectively applied on afferent fibers and efferent fibers of the hippocampal CA1 region in anaesthetized rats. Synchronized firings of neuronal action potential (i.e., population spike, PS) of CA1 pyramidal cells were examined. Results showed that 50 Hz orthodromic-HFS induced persistent PS firings, while 100 and 200 Hz orthodromic-HFS induced much less PS firings. During antidromic-HFS with different frequencies, every stimulation pulse evoked a PS. However, the PS amplitude decreased gradually. The decrease of PS amplitude was more rapid with higher stimulation frequency. Taken together, the HFS of axons has excitatory effects on the neuronal populations both upstream and downstream. But the higher the stimulation frequency is, the less the excitatory effect is. These results are important for the further understanding of DBS mechanisms and for the safe and effective application of DBS in clinic.

deep brain stimulation; high frequency stimulation; hippocampus; population spike; neural network

10.3969/j.issn.0258-8021. 2014. 02.008

2013-10-29， 錄用日期:2013-12-15

國家自然科學基金(30970753)

R338, R318

A

0258-8021(2014) 02-0186-08

*通信作者。E-mail: fengzhouyan@139.com