李松巖,張宸豪,李文平,李 妍*

(1.吉林醫(yī)藥學(xué)院檢驗(yàn)學(xué)院，吉林 吉林 132013;2.吉林司法警官職業(yè)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130216)

·論 著·

NCTD和IFN-γ對(duì)Jurkat細(xì)胞mTRAIL表達(dá)的影響

李松巖1，2,張宸豪1,李文平1,李 妍1*

(1.吉林醫(yī)藥學(xué)院檢驗(yàn)學(xué)院，吉林 吉林 132013;2.吉林司法警官職業(yè)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130216)

目的 研究NCTD和IFN-γ對(duì)T細(xì)胞Jurkat TRAIL 表達(dá)的影響。方法 培養(yǎng)Jurkat,用不同濃度的IFN-γ和NCTD處理細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞表面TRAIL表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)活性氧水平。結(jié)果 IFN-γ以濃度依賴的方式上調(diào)Jurkat細(xì)胞TRAIL表達(dá)，而NCTD可增強(qiáng)IFN-γ對(duì)TRAIL的上調(diào)效應(yīng)；NCTD可增加細(xì)胞內(nèi)活性氧的表達(dá)。結(jié)論 NCTD可能通過(guò)活性氧調(diào)節(jié)的信號(hào)途徑協(xié)同IFN-γ增強(qiáng)TRAIL的表達(dá)。

腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體;去甲斑蝥素;活性氧

腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(TNF-related apoptosis inducing ligand,TRAIL) 可表達(dá)于免疫效應(yīng)細(xì)胞和部分腫瘤細(xì)胞表面。膜型TRAIL(membrane-bounding TRAIL,mTRAIL)及重組TRAIL(recombinant TRAIL,rTRAIL)均能選擇性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞凋亡,而赦免正常細(xì)胞[1-2]。新近證實(shí)，金屬蛋白酶家族成員參與 TRAIL 的酶切脫落,成為可溶型TRAIL(soluble TRAIL,sTRAIL)。病毒感染、腫瘤、自身免疫病等疾病情況下，血清中 sTRAIL 含量增加。經(jīng)干擾素 (interferons，IFNs)誘導(dǎo)后的中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞也可釋放sTRAIL，但mTRAIL表達(dá)減少。雖然重組的TRAIL蛋白和脫落sTRAIL被證實(shí)可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，但mTRAIL殺傷腫瘤的效應(yīng)更強(qiáng)。去甲斑蝥素(norcanthar idin,NCTD) 是中藥斑蝥的有效成分[3]。近年發(fā)現(xiàn)，NCTD具有誘導(dǎo)細(xì)胞分化的作用，是否可調(diào)節(jié)mTRAIL的表達(dá)未見(jiàn)報(bào)道，本研究以人T細(xì)胞Jurkat為模型，分析NCTD和IFN-γ對(duì)mTRAIL表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材 料

Jurkat保存于液氮中。PE標(biāo)記鼠抗人TRAIL、重組IFN-γ購(gòu)自eBioscinece公司(美國(guó)),NCTD 購(gòu)自國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心?；钚匝跆结橂p氯熒光黃乙酸乙酯(Dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA)購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)前1周復(fù)蘇細(xì)胞，以含10%小牛血清的1640培養(yǎng)液在37 ℃、5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，用培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞密度為3×105/mL,按10mL/孔接種于培養(yǎng)瓶。加入不同濃度NCTD(0.025、0.05和0.1 μmol/L)和NCTD(0和7.5μmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)16 h后，收集細(xì)胞。

1.3 TRAIL表達(dá)分析

收集細(xì)胞，PBS洗滌2次后，調(diào)為密度2×106/mL的細(xì)胞懸液。取200 μL細(xì)胞懸液，加入2 μL PE標(biāo)記鼠抗人TRAIL抗體,對(duì)照組加入PE標(biāo)記同型對(duì)照抗體；震蕩混勻后室溫避光反應(yīng)30 min；PBS洗滌2次后重懸于500 μL PBS；立即用流式細(xì)胞儀分析。

1.4 細(xì)胞內(nèi)活性氧檢測(cè)

收集細(xì)胞，用PBS調(diào)為密度2×106/mL的細(xì)胞懸液，取500 μL細(xì)胞懸液，加入DCFH-DA儲(chǔ)存液，至其終濃度為5 μmol/L，混勻后在37 ℃避光反應(yīng)30 min，PBS 洗2次后用流式細(xì)胞儀分析。

2 結(jié) 果

2.1 NCTD和IFN-γ對(duì)mTRAIL表達(dá)的影響

不同濃度 NCTD和IFN-γ誘導(dǎo)16 h后，流式細(xì)胞術(shù)分析Jurkat細(xì)胞膜表面 TRAIL表達(dá)，取3次試驗(yàn)TRAIL陽(yáng)性表細(xì)胞百分率的均值(表1)。IFN-γ以濃度依賴的方式上調(diào)mTRAIL的表達(dá)，當(dāng)NCTD與IFN-γ聯(lián)合作用后，mTRAIL表達(dá)進(jìn)一步增加。

表 1 IFN-γ和NCTD對(duì)mTRAIL表達(dá)的影響(%)

*與IFN-γ單獨(dú)作用組比較，P<0.05

2.2 NCTD和IFN-γ對(duì)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的影響

ROS探針DCFH-DA 進(jìn)入細(xì)胞后被酯酶水解為DCFH，后者被氧化后生成黃綠色熒光物質(zhì)，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其熒光值則代表細(xì)胞內(nèi)ROS相對(duì)含量(表2)。

3 討 論

NCTD是斑蝥的主要藥效成分，其殺傷腫瘤細(xì)胞主要機(jī)制為抑制細(xì)胞有絲分裂和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。有

表 2 IFN-γ和NCTD對(duì)ROS含量的影響

*與IFN-γ單獨(dú)作用組比較，P<0.05

學(xué)者報(bào)道，NCTD具有誘導(dǎo)細(xì)胞分化、阻止腫瘤細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化等作用。此外，NCTD還能調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體相關(guān)的應(yīng)激途徑，影響腫瘤細(xì)胞對(duì)其他化療藥物敏感性的效應(yīng)[4-5]。ROS可激活JNK激酶，因此ROS/JNKs 是細(xì)胞內(nèi)重要的應(yīng)激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。JNKs通過(guò)對(duì)下游轉(zhuǎn)錄因子磷酸化的調(diào)節(jié)，影響細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)靶分子的表達(dá)；NCTD可能通過(guò)ROS/JNK途徑上調(diào)mTRAIL表達(dá)[6]。但其通過(guò)哪種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)TRAIL表，以及mTRAIL的增加是否與NCTD對(duì)金屬蛋白酶表達(dá)和活性相關(guān)，還需要進(jìn)一步研究。

[1] 李 妍,金伯泉.可溶型細(xì)胞因子受體產(chǎn)生機(jī)制的研究進(jìn)展[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2012,28(5):551-553,556.

[2] 李 妍，王月華，金 宏，等.膜型凋亡誘導(dǎo)配體脫落可能參與肺腺癌對(duì) TRAIL 耐受[J].吉林醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2013,34(1)：39-43.

[3] 張金梅,吳 杰,常 城,等.去甲斑蝥素對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響[J].中國(guó)腫瘤生物治療雜志,2011,18(1):33-37.

[4] Geserick P,Drewniok C,Hupe M,et al.Suppression of cFLIP is sufficient to sensitize human melanoma cells to TRAIL- and CD95L-mediated apoptosis[J].Oncogene,2008,27(22):3211-3220.

[5] Li Ying,Sun Yan,Liu Fuyou,et al.Norcantharidin inhibits renal interstitial fibrosis by blocking the tubular epithelial-mesenchymal transition[J].PLoS One,2013,8(6):e66356.

[6] Gopalan A,Yu Weiping,Sanders B G,et al.Simvastatin inhibition of mevalonate pathway induces apoptosis in human breast cancer cells via activation of JNK/CHOP/DR5 signaling pathway[J].Cancer Lett,2013,329(1):9-16.

The effect of NCTD and IFN-γ on mTRAIL expression in Jurkat cells

LI Song-yan1，2,ZHANG Chen-hao1,LI Wen-ping1,LI Yan1*

(1.School of Medical Laboratory,Jilin Medical College,Jilin City，Jilin Province,132013；2.Jilin Judicial and Police Official College,Changchun,Jilin Province,130216，China)

Objective To study the effect of NCTD and IFN-γ on mTRAIL expression in Jurkat cells. Methods Jurkat cell was cultured in the medium of the different concentration of NCTD and IFN-γ.The TRAIL expression on the cell surface and the active oxygen levels in the cell were analyzed by flow cytometry. Results TRAIL’s expression of Jurkat were increased in a concentration dependent manner by IFN-γ and the effect of IFN-γ on TRAIL could be enhanced by NCTD;The active oxygen expression in the cells could be enhanced by NCTD. Conclusion TRAIL cells expression can be enhanced by NCTD in the way of signal pathway in regulating active oxygen.

TRAIL;NCTD;active oxygen

1673-2995(2014)01-0010-02

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(82102953)；吉林省科技廳中青年科技創(chuàng)新領(lǐng)軍人才及團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(20130521018JH)；吉林省教育廳“十二五”科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(2011420).

李松巖(1973-)，男(漢族)，講師,碩士.

李 妍(1972-)，女(漢族)，教授，博士.

R392

A

2013-11-04)