胡晶晶，楊珺超，汪 潞，江立斌△

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，浙江杭州310053；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院、浙江省中醫(yī)院，浙江杭州310006）

哮喘是一種異質(zhì)性疾病，通常以慢性氣道炎癥為特征。其定義包括呼吸道癥狀如隨時(shí)間而強(qiáng)度變化的喘息、氣短、胸悶與咳嗽，伴隨不同程度的呼氣氣流受限，是一種與免疫、遺傳、感染、環(huán)境等眾多因素相關(guān)的疾病。目前研究發(fā)現(xiàn)氣道重構(gòu)與重癥哮喘所導(dǎo)致的肺功能下降密切相關(guān)，近年來(lái)其被認(rèn)為是引起不可逆性氣道阻塞和難治性哮喘的病理基礎(chǔ)和重要原因之一[1]，但是哮喘引起氣道重構(gòu)的發(fā)病機(jī)制至今尚未闡明。在正常生理情況下，基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）及其組織抑制物-1（TIMP-1）保持平衡狀態(tài)，MMP-9/TIMP-1 失衡則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)代謝異常，參與氣道重塑過(guò)程[2]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立小鼠哮喘模型，探討穿山龍總皂苷對(duì)哮喘氣道重構(gòu)的作用及對(duì)MMP-9、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1（TIMP-1）表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

清潔級(jí)雌性BALB/c 小鼠60 只，6～8 周齡，體質(zhì)量（18±2）g。隨機(jī)分成6 組，每組10 只：A 組（正常對(duì)照組），B 組（哮喘模型組），C 組[陽(yáng)性對(duì)照組（醋酸潑尼松組）]，D 組（穿山龍總皂苷低劑量組），E組（穿山龍總皂苷中劑量組），F(xiàn) 組（穿山龍總皂苷高劑量組）。

1.2 動(dòng)物模型的建立

采用卵白蛋白（OVA）注射霧化吸入致敏激發(fā)法復(fù)制哮喘小鼠模型。取0.05 mg OVA+10%硫酸鋁鉀混懸液0.1 mL 于實(shí)驗(yàn)第0 天和第12 天腹腔注射以致敏小鼠，第18-23 天連續(xù)每天予5% OVA 生理鹽水溶液超聲霧化激發(fā)，30 min/次，1 次/d，第26 天起，予5% OVA 生理鹽水溶液超聲霧化激發(fā)，30 min/次，3 次/周，末次霧化為第55 天。霧化在30*40*40crn 大小的透明塑料盒中分組進(jìn)行。正常對(duì)照組用等量生理鹽水替代OVA 混懸液進(jìn)行腹腔注射和霧化吸入。

1.3 藥物干預(yù)

各組分別于實(shí)驗(yàn)第18 天起灌胃給藥，陽(yáng)性對(duì)照組給醋酸潑尼松混懸液10 mg/kg，治療組按穿山龍總皂苷高、中、低劑量組每天灌胃分別給予穿山龍總皂苷20 mg/kg、40 mg/kg、80 mg/kg。穿山龍總皂苷以含0.01%吐溫80 為溶媒的生理鹽水做溶劑，當(dāng)日配制。正常對(duì)照組、模型對(duì)照組給予相同體積的含上述溶媒的生理鹽水。各組均于實(shí)驗(yàn)第18 天起霧化吸入后給藥，每天1 次，連續(xù)給藥至第55 天。

1.4 標(biāo)本收集

每只小鼠最后1 次霧化激發(fā)后24 h 內(nèi)頸椎脫臼處死，開(kāi)胸，用含1%肝素的無(wú)菌生理鹽水100 mL快速?zèng)_洗肺血管床后，取肺組織存于-80 ℃冰箱。

1.5 HE 染色

取適量肺組織用生理鹽水沖洗干凈后利用10%中性福爾馬林溶液固定，常規(guī)脫水，石臘包埋。制成切片后行HE 染色，中性樹(shù)脂封片，光學(xué)顯微鏡觀察氣道粘膜組織形態(tài)，測(cè)定氣道平滑肌面積和氣道內(nèi)壁面積，觀察炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度等。

1.6 蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測(cè)MMP-9、TIMP-1 蛋白的表達(dá)

以蛋白裂解液提取部分肺組織總蛋白質(zhì)，以BCA 法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。取30 μg 蛋白樣品經(jīng)12%的十二烷基磺酸鈉－聚丙酰胺凝膠電泳分離后，半干電轉(zhuǎn)至PVDF 膜上。1%牛血清白蛋白（BSA）4 ℃封閉過(guò)夜。0.05%的Tween-20 磷酸鹽緩沖液（PBST）洗膜后與1∶400 的Ⅰ抗（羊抗鼠α-SMA、MMP-9和TIMP-1 多克隆抗體）反應(yīng)2h。然后與1∶3 000 的辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的Ⅱ抗（兔抗羊IgG）孵育1h。β-Actin Ⅰ抗（羊抗鼠β-Actin 多克隆抗體）濃度為1∶500，辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的Ⅱ抗（兔抗羊IgG）濃度為1∶5 000。DAB 顯色。目的蛋白呈棕紅條帶，晾干后拍照，以凝膠成像系統(tǒng)掃描比較。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS12.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用（x±s）表示，各指標(biāo)間比較用單因素方差分析，隨后采用q 檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。2 組數(shù)據(jù)相關(guān)分析采用spearman 等級(jí)相關(guān)分析。計(jì)數(shù)資料分析采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 穿山龍總皂苷對(duì)哮喘小鼠支氣管肺組織病理學(xué)的影響

空白組小鼠氣道上皮結(jié)構(gòu)正常，氣道周?chē)匆?jiàn)淋巴細(xì)胞及其他炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)。見(jiàn)圖1A。模型組小鼠氣管上皮變性，氣道壁明顯增厚，黏膜下及管壁周?chē)写罅垦仔约?xì)胞浸潤(rùn)，氣道平滑肌增厚，見(jiàn)圖1B。陽(yáng)性對(duì)照組可見(jiàn)氣道壁及上皮結(jié)構(gòu)等方面較哮喘組均改善，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，但未完全消失。穿山龍總皂苷低、中、高劑量組小鼠支氣管平滑肌的增厚、肺泡壁水腫及氣道炎性細(xì)胞浸潤(rùn)均有所改善，見(jiàn)圖1C、D、E，其中高劑量組改善最為明顯。

圖1 各組肺組織病理（HE 染色，×100）

2.2 應(yīng)用Western blot 法測(cè)定穿山龍總皂苷對(duì)氣道重構(gòu)相關(guān)蛋白MMP-9 及TIMP-1 的表達(dá)

與空白對(duì)照組比較，小鼠哮喘模型組MMP-9表達(dá)明顯升高（P＜0.05），TIMP-1 表達(dá)明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，各治療組MMP-9 表達(dá)明顯降低（P＜0.05），TIMP-1 表達(dá)明顯升高（P＜0.05）；但MMP-9 在各穿山龍總皂苷組表達(dá)強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照組，TIMP-1 在各穿山龍總皂苷組表達(dá)弱于陽(yáng)性對(duì)照組；穿山龍總皂苷各劑量組MMP-9 表達(dá)隨劑量增加而降低，TIMP-1 表達(dá)隨劑量增加而增加。（圖2a、b）。

圖2 穿山龍總皂苷對(duì)MMP-9 及TIMP-1 蛋白表達(dá)的影響

3 討論

哮喘發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，目前認(rèn)為，變態(tài)反應(yīng)、氣道炎癥、氣道重構(gòu)等方面共同參與哮喘的發(fā)病過(guò)程[3]。氣道慢性炎癥被認(rèn)為是哮喘的基本的病理改變和哮喘反復(fù)發(fā)作的主要病理生理機(jī)制[4]。但近來(lái)諸多實(shí)驗(yàn)顯示單純抗炎治療對(duì)哮喘的治療卻不甚理想[5]。氣道長(zhǎng)期持續(xù)性的炎癥反復(fù)發(fā)作，反復(fù)修復(fù)，會(huì)導(dǎo)致組織增生而發(fā)生重塑[6]。因此只有控制或者逆轉(zhuǎn)了氣道重構(gòu)，哮喘才可能得到真正意義上的控制。

目前研究表明：細(xì)胞外基質(zhì)(ECM) 在氣道壁降解與沉積失衡、氣管平滑肌(airwaysmoothmusele,ASM)增生肥大、基底膜增厚及管壁玻璃樣變是支氣管哮喘氣道重塑的重要原因之一。ECM 降解中起關(guān)鍵作用的是基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)，是ECM 代謝的主要限速酶，具有限制ECM 降解的作用，從而使ECM 沉積增加[7]，而基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物(TIMPs)是MMPs 的特異性抑制劑，它可抑制MMPs 的活性而使ECM 降解增加，沉積減少。MMP-9 及其抑制劑TIMP-1 與哮喘氣道重塑關(guān)系最大[7-8]。研究證實(shí)MMP-9/TIMP-1 失衡可能是急性或慢性哮喘的特征。在對(duì)哮喘患者的研究中發(fā)現(xiàn)，由于炎癥的反復(fù)刺激，MMP-9 表達(dá)失衡，表現(xiàn)為EMC 降解和合成紊亂，進(jìn)而導(dǎo)致氣道異常修復(fù)和損傷，最終發(fā)展成氣道重構(gòu)[9-10]。

中藥穿山龍為薯蕷科植物穿龍薯蕷（Dioscorea nipponica Makino）的干燥根莖。多用于治療風(fēng)寒濕痹、慢性氣管炎、消化不良、勞損扭傷等?，F(xiàn)代藥理研究表明，穿山龍具有調(diào)節(jié)免疫、改善心血管功能、鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘等多種藥理作用，可用于治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、冠心病心絞痛、慢性氣管炎、慢性布魯菌病、脂肪瘤等疾病[11-12]。據(jù)抗炎反應(yīng)試驗(yàn)，穿山龍?jiān)谠嚬苤械臐舛却篌w相當(dāng)于血中有效濃度時(shí)，有抑制過(guò)敏介質(zhì)釋放的作用及調(diào)節(jié)免疫的作用[13～14]。在許多中醫(yī)藥復(fù)方中均選用了穿山龍作為主要藥物治療支氣管哮喘；穿山龍注射液也被用于穴位注射治療重癥支氣管哮喘，有資料表明效果明顯[15]。但穿山龍總皂苷治療支氣管哮喘的實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道較少。而穿山龍總皂苷對(duì)哮喘氣道壁重塑的影響及其可能機(jī)制未見(jiàn)報(bào)道。

傳統(tǒng)的中醫(yī)認(rèn)為哮喘病因病機(jī)主要以"痰飲"為主，治療中采用化痰等方法能取得很好的療效。本文研究結(jié)果顯示，對(duì)于哮喘小鼠，穿山龍可改善氣道壁及氣道上皮結(jié)構(gòu)，減少黏膜下及管壁周?chē)仔约?xì)胞浸潤(rùn)，在進(jìn)一步機(jī)制研究中我們發(fā)現(xiàn)，陽(yáng)性對(duì)照組及低、中、高劑量組MMP-9 和TIMP-1 表達(dá)水平均較哮喘模型組改善，并且穿山龍與陽(yáng)性對(duì)照組有類(lèi)似的減輕氣道重塑的作用機(jī)制，此外，我們還發(fā)現(xiàn)MMP-9 表達(dá)強(qiáng)度可能隨穿山龍總皂苷劑量的增加而減弱，TIMP-1 表達(dá)強(qiáng)度可能隨穿山龍總皂苷劑量的增加而增加。說(shuō)明穿山龍總皂苷可能是通過(guò)抑制肺組織內(nèi)MMP-9、增加TIMP-1 的表達(dá)而減輕氣道重塑，這與醋酸潑尼松減輕氣道重塑的機(jī)制類(lèi)似。

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