王念武，王 婷，沈建國，胡方平*

(1.福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，福州 350002； 2.福建出入境檢驗(yàn)檢疫局,福州 350001)

實(shí)驗(yàn)方法與技術(shù)

番茄細(xì)菌性葉斑病菌超分支滾環(huán)擴(kuò)增快速檢測技術(shù)

王念武1,2，王 婷1，沈建國2，胡方平1*

(1.福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，福州 350002； 2.福建出入境檢驗(yàn)檢疫局,福州 350001)

根據(jù)番茄細(xì)菌性葉斑病菌(Pseudomonassyringaepv.tomato,Pst)的一段特異蛋白基因序列，按照鎖式探針的設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)探針和擴(kuò)增引物，優(yōu)化系列反應(yīng)條件，建立了特異性的Pst超分支滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)。試驗(yàn)結(jié)果表明：該檢測技術(shù)能夠從供試的10種不同的病原菌中特異性地檢測出番茄細(xì)菌性葉斑病菌，DNA檢測的最低濃度為500fg/μL，檢測靈敏度高于常規(guī)PCR。

番茄細(xì)菌性葉斑病菌； 超分支滾環(huán)擴(kuò)增； 鎖式探針

番茄細(xì)菌性葉斑病(bacterial speck of tomato)是番茄上重要的病害之一，病原菌為Pseudomonassyringaepv.tomato(Okabe) Young ，Dye & Wilkie(Pst)。該病害最早于1933年在美國的布雷登頓市被發(fā)現(xiàn)，但因?yàn)檫@種病害很容易和其他細(xì)菌性病害混淆，致使在其他地方很少被報(bào)道，直到1977-1978年在霍姆斯特德地區(qū)大暴發(fā)之后才被重視[1]。該病菌僅危害番茄，可造成葉片斑點(diǎn)、壞死，導(dǎo)致植株生長不良而減產(chǎn)；在果實(shí)上危害形成瑕疵癥狀，影響番茄的感官品質(zhì)而導(dǎo)致難以銷售[2]。該病害因缺少典型的診斷鑒別癥狀極易和其他病害的癥狀混淆，另外，病原菌又可由種子攜帶，所以對該病害的快速診斷和病原菌的快速檢測是植病工作者的研究內(nèi)容之一。

傳統(tǒng)的方法可用于診斷和鑒定P.syringaepv.tomato病原，但費(fèi)力費(fèi)時(shí)；用非放射性元素標(biāo)記DNA探針可用于檢測番茄植株上的葉斑病菌，但因菌株自身產(chǎn)生毒素，檢測結(jié)果常受到影響[3]；Zaccardelli等[4]利用hrpZ基因特異性序列通過常規(guī)PCR方法來檢測受感染的植株和幼苗，獲得了一定的成功。但常規(guī)PCR的方法有一定的局限性，容易受污染形成假陽性結(jié)果，而且不能高通量檢測病原物。自鎖式探針被報(bào)道以來[5]，它以靈敏、特異、穩(wěn)定等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用到分子檢測中。鎖式探針是由3′和5′端兩段靶標(biāo)序列和中間的一段對檢測結(jié)果沒有影響的連接序列構(gòu)成的一種較長的單鏈寡核苷酸片段。其工作原理是當(dāng)檢測體系中存在靶標(biāo)DNA時(shí)，鎖式探針兩端的靶標(biāo)序列就會(huì)與靶標(biāo)DNA完全互補(bǔ)配對，線型鎖式探針在連接酶的作用下被有效地連接成環(huán)型，而在沒有相應(yīng)靶標(biāo)DNA存在時(shí)鎖式探針不被連接酶連接，僅以線性形式存在。在核酸外切酶的作用下，多余的線性鎖式探針被消化水解，連接成環(huán)狀的鎖式探針在BstDNA聚合酶和通用引物的作用下恒溫?cái)U(kuò)增[6]，其擴(kuò)增效率在1h之內(nèi)就可以達(dá)到109或更多拷貝[7]。鎖式探針的恒溫?cái)U(kuò)增具有極好的檢測靈敏度、特異性和實(shí)用性，近幾年已被廣泛地應(yīng)用于細(xì)胞原位檢測、微生物、醫(yī)學(xué)病原檢測鑒定等領(lǐng)域[8-9]。Schopf 等[10]通過瓊脂糖珠表面修飾擴(kuò)增引物，然后進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增，并通過熒光探針檢測，DNA檢測限達(dá)到1amol；Su等[11]利用一種高靈敏的磁珠電化學(xué)發(fā)光方法，結(jié)合滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)來分析單鏈核苷酸多態(tài)性，結(jié)果可以將1/100000突變型樣品從野生型中區(qū)分開；Li等[12]利用納米技術(shù)結(jié)合滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)，通過金納米粒子探針與酶消化的滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物雜交，實(shí)現(xiàn)用肉眼比較顏色來進(jìn)行檢測；Cheng等[13]在雙抗體免疫夾心的基礎(chǔ)上建立了免疫滾環(huán)擴(kuò)增方法，通過在引物5′ 端標(biāo)記生物素，實(shí)現(xiàn)探針與擴(kuò)增產(chǎn)物原位雜交檢測；Yan等[14]利用了納米金能夠同時(shí)結(jié)合蛋白和核酸的特性，將用于RCA反應(yīng)的DNA引物和抗體通過納米金連接起來，形成一個(gè)更強(qiáng)信號(hào)的擴(kuò)增反應(yīng)，其靈敏度可達(dá)到5 amol/L，比傳統(tǒng)的ELISA方法擴(kuò)大5個(gè)數(shù)量級(jí)；郭艷玲等[15]用超分支滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)對60例肺結(jié)核病人、38例非結(jié)核對照組和20例健康人的痰標(biāo)本進(jìn)行檢測，靈敏度達(dá)740amol/L，檢測菌懸液的靈敏度達(dá)200cfu/mL；在植物病原檢測中，Szemes等[6]設(shè)計(jì)了11種鎖式探針，采用鎖式探針與微陣列相結(jié)合的方法，對11種植物病原物(真菌和線蟲)進(jìn)行分析，建立了特異性強(qiáng)、靈敏度高的檢測技術(shù)體系，黃冠軍[16]等據(jù)柑橘潰瘍病菌(Xanthomonasaxonopodispv．citri)獨(dú)有的蛋白基因序列設(shè)計(jì)特異性鎖式探針進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增，建立了柑橘潰瘍病菌滾環(huán)擴(kuò)增檢測技術(shù)體系。本研究旨在依據(jù)番茄細(xì)菌性葉斑病菌獨(dú)有的蛋白基因序列，設(shè)計(jì)特異的鎖式探針及其擴(kuò)增引物，建立特異、靈敏的番茄細(xì)菌性葉斑病菌超分支滾環(huán)擴(kuò)增(HRCA)檢測技術(shù)，為我國的口岸把關(guān)，也為番茄細(xì)菌性葉斑病菌的疫情動(dòng)態(tài)監(jiān)測提供新的分子檢測技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

番茄潰瘍病菌[Clavibactermichiganensissubsp.michiganensis(Smith)Davis et al.]，由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所邱思鑫提供；番茄細(xì)菌性葉斑病菌(Pseudomonassyringaepv.tomato)、番茄青枯病菌[Ralstoniasolanacearum(Smith) Yabuuchi et al.]、西瓜細(xì)菌性果斑病菌(Acidovoraxavenaesubsp.citrulliWillems et al.)、水稻細(xì)菌性條斑病菌[Xanthomonasoryzaepv.oryzicola(Fang et al.) Swing et al.]、楊桃細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌[P.syringaepv.averrhoii(van Hall) Bergey]、柑橘潰瘍病菌[Xanthomonascitri(Hasse) Dawson]、枯草芽胞桿菌[Bacillussubtilis(Ehrenberg) Cohn]、香蕉枯萎病菌[Fusariumoxysporumf.sp.cubense(E.F.Smith) W.C.Snyd.& H.N.Hans.]、香蕉炭疽病菌[Colletotrichummusae(Berk.& Curt.) Arx.]均由福建農(nóng)林大學(xué)細(xì)菌實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 主要試劑和儀器

TaqDNA ligase、Exonuclease I、Exonuclease Ⅲ、BstDNA polymerase、無菌 ddH2O均購自New England Biolabs(NEB)公司。dNTPs、DNA提取試劑盒，100bp DNA ladder，分別購自Promega和Tangen公司。PCR儀(ABI公司)、核酸蛋白儀、凝膠成像系統(tǒng)、離心機(jī)(Eppendorf公司)。

1.2 鎖式探針的設(shè)計(jì)

根據(jù)Fanelli等[17]獲得的一段255 bp大小的番茄細(xì)菌性葉斑病菌特異性片段(GenBank: AJ581671.1)，按照鎖式探針的設(shè)計(jì)原則[6,18]采用軟件Oligo和DNASTAR設(shè)計(jì)鎖式探針。設(shè)計(jì)的鎖式探針兩端檢測臂T1、T2和Pst的特異性片段堿基序列互補(bǔ)，鎖式探針中間的一段連接區(qū)域采用小鼠基因xist(NCBI Reference Sequence: NR_001463.3)一段序列，設(shè)計(jì)好的鎖式探針使用Mfold(http:∥www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/)預(yù)測探針的二級(jí)結(jié)構(gòu)，確保鎖式探針的二級(jí)結(jié)構(gòu)最小。鎖式探針擴(kuò)增引物根據(jù)其連接序列設(shè)計(jì)，最后，將所設(shè)計(jì)的鎖式探針序列和擴(kuò)增引物在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比對，篩選出特異性強(qiáng)的鎖式探針和性能穩(wěn)定易于擴(kuò)增的擴(kuò)增引物。鎖式探針、擴(kuò)增引物均由上海生物工程有限公司合成，鎖式探針合成時(shí)對其5′端進(jìn)行磷酸化修飾。

表1番茄細(xì)菌性葉斑病菌的超分支滾環(huán)擴(kuò)增所用到的鎖式探針及其擴(kuò)增引物

Table1PadlockprobeandprimersofHCRAforPst

名稱Name序列(5′→3′)Sequence(5′→3′)長度/bpLengthpadlock?PstGCGAGTGGGCTAACTATGATTGGGAAATAAGTGGAACCGAGGAAATAGAGAACCCCATCCAGCACTTCCCTATGTCTCTCCCGTATGGTTTCTGCGTCACTGCGTTAC108padRCCATCCAGCACTTCCCTATGTCT23padFGGTTCTCTATTTCCTCGGTTCCAC24

1.3 超分支滾環(huán)擴(kuò)增檢測技術(shù)建立與優(yōu)化

1.3.1 鎖式探針環(huán)化連接

將鎖式探針與番茄細(xì)菌性葉斑病菌以及參照菌株的DNA模板分別進(jìn)行環(huán)化連接，反應(yīng)體系為10μL：10×TaqDNA連接酶緩沖液1μL，40U/μL的TaqDNA連接酶0.15 μL，400pmol/L鎖式探針0.2 μL，DNA模板2 μL，無菌ddH2O補(bǔ)足至10μL。采用熱循環(huán)法連接，反應(yīng)條件為：94 ℃ 4 min；94 ℃30s，65 ℃ 5 min，15個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 min滅活TaqDNA連接酶。反應(yīng)結(jié)束后立即將反應(yīng)管冰浴5 min。鎖式探針連接優(yōu)化包括線性鎖式探針的終濃度、DNA連接酶、連接程序選擇等，本文采用的是熱循環(huán)法，DNA連接酶采用的是NEB公司的TaqDNA連接酶，僅針對線性鎖式探針的終濃度進(jìn)行優(yōu)化，設(shè)置不同濃度的線性鎖式探針，按照上述方法進(jìn)行連接。

1.3.2 消化反應(yīng)

冰浴后的PCR反應(yīng)管中加入10μL的混合液：10×核酸外切酶I緩沖液2 μL；5 U/μL的核酸外切酶I 1.5 μL；10×核酸外切酶Ⅲ緩沖液2 μL；5 U/μL的核酸外切酶Ⅲ 1μL；無菌 ddH2O補(bǔ)足至10μL，37 ℃反應(yīng)2.5 h，徹底消化未環(huán)化的線性探針，再于95 ℃反應(yīng)3h，滅活剩余的核酸外切酶。

1.3.3 超分支滾環(huán)擴(kuò)增

將鎖式探針連接環(huán)化消化后的產(chǎn)物作為模板，用擴(kuò)增引物進(jìn)行超分支滾環(huán)擴(kuò)增，反應(yīng)體系為25 μL：10×BstDNA聚合酶緩沖液2.5 μL，8U/μL的BstDNA聚合酶0.5 μL，10μmol/L 的padR 0.5 μL，10μmol/L的padF 0.5 μL，10mmol/L的 dNTPs 1μL，環(huán)化連接消化后產(chǎn)物2 μL，無菌 ddH2O 補(bǔ)至25 μL。反應(yīng)條件：62.5 ℃反應(yīng)1.5 h。反應(yīng)結(jié)束后取7 μL于2.0%的瓊脂糖凝膠上電泳，溴乙錠染色，紫外凝膠成像系統(tǒng)照相分析。優(yōu)化時(shí)，設(shè)置不同的反應(yīng)溫度，溫度梯度為1℃，對滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行優(yōu)化。

1.4 超分支滾環(huán)擴(kuò)增檢測的特異性

將鎖式探針與番茄細(xì)菌性葉斑病菌以及參照菌株的DNA模板分別進(jìn)行環(huán)化連接，按照上述步驟進(jìn)行連接、消化、超分支滾環(huán)擴(kuò)增，測試并比較超分支滾環(huán)擴(kuò)增的特異性。

1.5 超分支滾環(huán)擴(kuò)增檢測的靈敏度測定

將提取的Pst的DNA，經(jīng)核酸蛋白儀測定濃度，再經(jīng)無菌ddH2O 10倍梯度稀釋后作為模板，各取2 μL按上述步驟進(jìn)行連接、消化、超分支滾環(huán)擴(kuò)增，以確定鎖式探針超分支滾環(huán)擴(kuò)增的最低檢測DNA濃度。

1.6 基于鎖式探針的PCR擴(kuò)增

將連接、消化后的環(huán)化鎖式探針作為模板，用擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系20μL：2×PCR buffer 10μL，10μmol/L的 padR 0.5 μL，10μmol/L的 padF 0.5 μL，鎖式探針環(huán)化連接、消化反應(yīng)后產(chǎn)物2 μL，無菌ddH2O 補(bǔ)足至20μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30s，62 ℃ 30s，72 ℃ 30s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 8 min。

2 結(jié)果和分析

2.1 番茄細(xì)菌性葉斑病菌超分支滾環(huán)擴(kuò)增檢測技術(shù)建立

整個(gè)超分支滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)包括線性鎖式探針的連接環(huán)化，核酸外切酶消化和滾環(huán)擴(kuò)增三部分。連接反應(yīng)試驗(yàn)中優(yōu)化了線性探針的終濃度；消化反應(yīng)試驗(yàn)中分別優(yōu)化了核酸外切酶I、Ⅲ的量和作用時(shí)間；滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)中優(yōu)化了反應(yīng)溫度。研究結(jié)果表明，線性探針終濃度為8 pmol/L時(shí)，連接效果最好(圖 1)，超分支滾環(huán)擴(kuò)增的最適反應(yīng)溫度為62 ℃(圖 2)。采用熱循環(huán)連接法對終濃度為8 pmol/L的鎖式探針進(jìn)行連接，然后用10U的核酸外切酶Ⅰ和6U核酸外切酶Ⅲ消化2.5 h，可以提高連接效率，有效消除未環(huán)化的線性探針的影響。用優(yōu)化后的體系進(jìn)行連接、消化和滾環(huán)擴(kuò)增，Pst的DNA作為靶標(biāo)序列，無菌ddH2O作空白對照，獲得Pst特異的HRCA產(chǎn)物，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果出現(xiàn)了典型的階梯狀的條帶分布(圖3)，條帶的大小為108 bp+108×N(N≥0) bp。

圖1 鎖式探針終濃度的優(yōu)化Fig.1 Optimization of the final concentration for padlock probe

圖2 超分支滾環(huán)擴(kuò)增的溫度優(yōu)化Fig.2 Optimization of the reaction temperature for HRCA

圖3 番茄細(xì)菌性葉斑病菌超分支滾環(huán)擴(kuò)增電泳分析Fig.3 Electrophoretic analysis of HRCA for Pst

2.2 超分支滾環(huán)擴(kuò)增檢測的特異性

超分支滾環(huán)擴(kuò)增檢測的特異性試驗(yàn)結(jié)果表明：在供試的10種病原菌中，只有番茄細(xì)菌性葉斑病菌能被特異性檢出，其余9種病原菌均不能檢出(圖4a),試驗(yàn)使用Zaccardelli等[4]報(bào)道的PCR方法對供試的10種病原菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增,只有Pst可以擴(kuò)增出532 bp目標(biāo)片段(圖4b)，與超分支滾環(huán)擴(kuò)增結(jié)果相同，由此表明，建立的番茄細(xì)菌性葉斑病菌超分支滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)對該病菌有特異性，可以用于快速檢測。

圖4 番茄細(xì)菌性葉斑病菌超分支滾環(huán)擴(kuò)增的特異性Fig.4 The specificity of HRCA for Pst

2.3 超分支滾環(huán)擴(kuò)增檢測的靈敏度

超分支滾環(huán)擴(kuò)增檢測的靈敏度試驗(yàn)結(jié)果表明，HRCA檢測靈敏度高，最低DNA檢測濃度為500fg/μL，Pst的DNA濃度為500fg/μL時(shí)，可以檢測到，但電泳條帶較微弱，當(dāng)濃度小于500fg/μL時(shí)，則檢測不到(圖 5)。用Zaccardelli 等[4]報(bào)道的PCR方法檢測的靈敏度為5 pg/μL(圖 5)，可見HCRA方法檢測靈敏度更高，比常規(guī)PCR方法的靈敏度高出一個(gè)數(shù)量級(jí)。

圖5 番茄細(xì)菌性葉斑病菌超分支滾環(huán)擴(kuò)增檢測的靈敏度Fig.5 The sensitivity of HRCA for Pst

2.4 基于鎖式探針的PCR擴(kuò)增

鎖式探針經(jīng)過環(huán)化后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)凝膠電泳成像，得到預(yù)期的約108 bp的目標(biāo)片段(圖6)，而供試的其他病原菌未擴(kuò)增出目標(biāo)片段，其特異性和HRCA的特異性是一致的(圖 4，圖6)。

圖6 番茄細(xì)菌性葉斑病菌基于鎖式探針的PCR擴(kuò)增Fig.6 The padlock-dependent PCR for Pst

3 討論

番茄細(xì)菌性葉斑病是一種危害嚴(yán)重的病害，其檢測方法有很多種，但都有一定的缺陷，現(xiàn)行的血清學(xué)檢測和膠體金免疫檢測等常規(guī)診斷方法檢測靈敏度低而容易造成假陰性，定性PCR或定量PCR檢測技術(shù)均是對檢測靶標(biāo)DNA的擴(kuò)增，增加了交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)[19]?；阪i式探針的超分支滾環(huán)擴(kuò)增(HRCA)技術(shù)僅特異性地?cái)U(kuò)增環(huán)化鎖式探針，不擴(kuò)增模板DNA，避免PCR擴(kuò)增檢測靶標(biāo)DNA的富集影響，最大限度地減少交叉污染風(fēng)險(xiǎn)，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、簡單易操作和高通量的特點(diǎn)。

鎖式探針具有很高的特異性及單堿基錯(cuò)配識(shí)別能力，當(dāng)錯(cuò)配位置在鎖式探針的3′末端時(shí)，很容易識(shí)別而不會(huì)連接，滾環(huán)擴(kuò)增后也不會(huì)產(chǎn)生擴(kuò)增信號(hào)；但是當(dāng)錯(cuò)配位置在5′端或3′端中部時(shí)，將不容易識(shí)別，滾環(huán)擴(kuò)增后能在凝膠電泳上檢測到電泳條帶[6,18]。所以在設(shè)計(jì)鎖式探針時(shí)，將鎖式探針的3′端選擇在與Pst堿基序列高度一致、而與近似種差異較大的堿基序列位置上，使得探針3′端與Pst靶標(biāo)DNA完全互補(bǔ)，而與非靶標(biāo)DNA 3′端存在錯(cuò)配，以保證設(shè)計(jì)的探針特異性。

線性鎖式探針對滾環(huán)擴(kuò)增有一定的影響，當(dāng)HRCA體系中同時(shí)存在線性探針和靶標(biāo)DNA時(shí)，會(huì)對滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)生背景信號(hào),形成一定干擾，因此，把線性探針消化掉非常重要[20-21]。報(bào)道只需要用核酸外切酶Ⅰ，就能特異性地降解線性 ssDNA。但Szemes[6]經(jīng)過試驗(yàn)證實(shí)，同時(shí)加入核酸外切酶Ⅰ與核酸外切酶Ⅲ進(jìn)行消化效果更好。在本研究中，采用了核酸外切酶Ⅰ與核酸外切酶Ⅲ消化，結(jié)果與Szemes的一致。

在本研究中，進(jìn)行了基于鎖式探針的常規(guī)PCR試驗(yàn)，得到預(yù)期的108 bp的目標(biāo)片段。用鎖式探針常規(guī)PCR的方法，避免了鎖式探針滾環(huán)擴(kuò)增時(shí)未環(huán)化的線性鎖式探針的非特異性影響。鎖式探針最大優(yōu)勢就是特異性和高通量檢測多種病原物，如果在同一反應(yīng)體系中用鎖式探針常規(guī)PCR的方法擴(kuò)增番茄上的多種病原細(xì)菌，并結(jié)合反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)，就可以實(shí)現(xiàn)番茄上多種病原細(xì)菌高通量檢測，這是我們下一步的研究目標(biāo)。

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RapiddetectionofPseudomonassyringaepv.tomatousinghyperbranchedrollingcircleamplification

Wang Nianwu1,2，Wang Ting1，Shen Jianguo2，Hu Fangping1

(1.CollegeofPlantProtection,FujianAgriculturalandForestryUniversity,Fuzhou350002,China;2.FujianBureauofExit-EntryInspectionandQuarantine,Fuzhou350001,China)

A padlock probe was designed based on the sequence of the unique hypothetic protein gene in the complete genome ofPseudomonassyringaepv.tomato(Pst),according to the design principle of padlock probe and primers.Detection system of hyperbranched rolling circle amplification (HRCA) was established and optimized.The results showed that Pst could be specifically detected by this method,while other reference plant pathogens could not be detected.The detection sensitivity of HRCA was about 500fg/μL of DNA concentration,higher than that of the conventional PCR method.

Pseudomonassyringaepv.tomato; hyperbranched rolling circle amplification; padlock probe

2013-04-23

：2013-07-14

國家質(zhì)檢總局項(xiàng)目(20011K158)；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30671463)；福建省發(fā)改委項(xiàng)目(KY0030060)

S 436.412

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.02.017

* 通信作者 E-mail: huf@fafu.edu.cn