盧美光，姜冬梅，張志想，李世訪

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，北京 100193)

會議與學(xué)術(shù)交流

“國際類病毒及衛(wèi)星病毒學(xué)術(shù)研討會”概況及主要研究進(jìn)展

盧美光，姜冬梅，張志想，李世訪*

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，北京 100193)

本文旨在對舉辦國際類病毒及衛(wèi)星病毒學(xué)術(shù)研討會的組織籌備、工作經(jīng)驗(yàn)等進(jìn)行交流，對大會學(xué)術(shù)交流所涉及的新類病毒/環(huán)狀RNA分子的鑒定及其風(fēng)險(xiǎn)評估、類病毒及衛(wèi)星RNA侵染導(dǎo)致寄主的反應(yīng)、類病毒的遺傳多樣性和復(fù)制以及類病毒的檢測技術(shù)及防治方法等四方面內(nèi)容的研究亮點(diǎn)及新進(jìn)展等進(jìn)行總結(jié)，希望對廣大科研工作者有一定的幫助。

類病毒； 衛(wèi)星病毒； 研討會； 主要研究進(jìn)展

1 會議概況

類病毒(viroid)是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最小病原物，在果樹、蔬菜以及花卉等園藝作物上引起嚴(yán)重病害，對園藝作物的產(chǎn)量和質(zhì)量造成嚴(yán)重?fù)p失。為了給類病毒及衛(wèi)星病毒研究工作者搭建高水平的學(xué)術(shù)交流與科研合作平臺，探討類病毒及衛(wèi)星病毒研究熱點(diǎn)、難點(diǎn)問題，推動我國類病毒及衛(wèi)星病毒學(xué)科的發(fā)展，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所等單位于2013年8月23-25日主辦了“國際類病毒及衛(wèi)星病毒學(xué)術(shù)研討會”。

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所與意大利植物病毒研究所充分利用“第十屆國際植物病理學(xué)大會(ICPP)”在北京召開的契機(jī)，在大會召開之前，積極組織承辦“國際類病毒及衛(wèi)星病毒學(xué)術(shù)研討會”。2012年2月，通過中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所李世訪研究員和意大利植物病毒研究所Francesco Di Serio研究員的前期聯(lián)系，得到“第十屆國際植物病理學(xué)大會”的支持，并得到來自美國、意大利、加拿大、澳大利亞、德國、日本、巴西、西班牙、波蘭、韓國及國內(nèi)40余位該領(lǐng)域?qū)＜业姆e極響應(yīng)。2012年3月“國際類病毒及衛(wèi)星病毒學(xué)術(shù)研討會”作為ICPP的衛(wèi)星會議，籌備工作正式開始。

2012年3月，成立了研討會的科學(xué)委員會和地方組織委員會。李世訪研究員和Francesco Di Serio研究員為會議召集人(會議主席)?？茖W(xué)委員會由國際植物病毒或類病毒研究領(lǐng)域的8位知名專家組成，分別為：福建農(nóng)林大學(xué)植物病毒研究所所長謝聯(lián)輝院士，植物細(xì)胞和分子生物學(xué)研究所西班牙研究委員會(CSIC)Ricardo Flores教授，美國農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究服務(wù)中心 Robert A.Owens教授，美國加州大學(xué)河濱分校植物病理學(xué)家丁守偉教授， 意大利植物病毒研究所Francesco Di Serio研究員，日本弘前大學(xué)Teruo Sano教授，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所李世訪研究員，美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)鮑一明博士。 地方組織委員會由12人組成，分別為：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)韓成貴教授、周濤副教授，浙江大學(xué)生物技術(shù)研究所周雪平教授， 內(nèi)蒙古大學(xué)張若芳教授，北京植物病理學(xué)會陳立新老師，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所周常勇研究員，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所邱德文、陳巨蓮、李世訪研究員，王立霞、盧美光副研究員，福建農(nóng)林大學(xué)吳祖建教授。

經(jīng)組委會申請，2012年7月獲得了舉辦“國際類病毒及衛(wèi)星病毒學(xué)術(shù)研討會”的中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院批文。為加強(qiáng)宣傳，構(gòu)建了研討會網(wǎng)站，設(shè)立了包含Home，Programme，Venue， Instructions to Authors，Important Deadlines，Registration，Organization，Contact Info等9個網(wǎng)頁框架的網(wǎng)站，并通過幾個月的網(wǎng)站內(nèi)容充實(shí)、修改和美化，于2012年8月在ICPP網(wǎng)站和中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所網(wǎng)站上正式發(fā)布。

為能順利舉辦會議，組委會積極申請會議經(jīng)費(fèi)。2012年4月，組委會為北京植物病理學(xué)會提供“國際類病毒及衛(wèi)星病毒學(xué)術(shù)研討會”專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)申報(bào)資料，為會議獲得了2013年北京市科協(xié)學(xué)會學(xué)術(shù)活動專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)的資助提供了保證。通過前期的積極準(zhǔn)備，2013年4月申報(bào)國家自然科學(xué)基金國際(地區(qū))合作與交流項(xiàng)目(在華召開國際(地區(qū))學(xué)術(shù)會議)，并獲得了國家自然科學(xué)基金委的資助。此外，經(jīng)積極聯(lián)系，還獲得了植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室及內(nèi)蒙古大學(xué)的支持和贊助。這些單位的經(jīng)費(fèi)支持極大地解決了大會資金不足等問題。

通過認(rèn)真考察、會議經(jīng)費(fèi)預(yù)算、會議地點(diǎn)等的比較，落實(shí)了會議場地、流程、代表住宿、餐飲、服務(wù)等相關(guān)事宜。組委會積極做好會前宣傳工作，除發(fā)布兩輪正式會議通知外，還通過互聯(lián)網(wǎng)定期給相關(guān)研究領(lǐng)域中外學(xué)者190余人發(fā)送英文有關(guān)參會通知和會議信息、參會指南、籌備情況等資料，并提前辦理相關(guān)代表簽證所需的官方邀請函，住房預(yù)訂等工作，及時處理會議郵件，保證了此次會議的規(guī)模和辦會的質(zhì)量。

經(jīng)過組委會的積極籌備，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所、北京植物病理學(xué)會、意大利植物病毒研究所和內(nèi)蒙古大學(xué)主辦，植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、中國植物病理學(xué)會、國家自然科學(xué)基金委員會協(xié)辦的“國際類病毒及衛(wèi)星病毒學(xué)術(shù)研討會”于2013年8月23—25日在北京國際會議中心隆重召開并獲得圓滿成功。

有分別來自美國、意大利、法國、加拿大、澳大利亞、日本、德國、西班牙、波蘭、韓國、馬來西亞、挪威、愛沙尼亞、沙特阿拉伯、斯洛文尼亞和中國等16個國家科研機(jī)構(gòu)、高等院校及政府部門的代表及志愿者共100多人參加了會議，其中外賓36人。大會共收到論文摘要39篇。學(xué)術(shù)研討會上，有5位國際知名專家做了特邀報(bào)告，28位研究學(xué)者就類病毒和衛(wèi)星RNA鑒定及其風(fēng)險(xiǎn)評估、類病毒和衛(wèi)星RNA侵染導(dǎo)致的寄主反應(yīng)、類病毒和衛(wèi)星RNA的復(fù)制及基因多樣性以及類病毒和衛(wèi)星RNA的檢測方法及防控技術(shù)等4個學(xué)術(shù)專題做了精彩的報(bào)告。

此次會議不僅為世界類病毒及衛(wèi)星病毒研究人員搭建了一個面對面交流的平臺，也促成了類病毒國際交流的常態(tài)化。經(jīng)過大會組委會與國際病毒分類委員會類病毒研究小組商榷，決定下屆研討會于2015在斯洛伐克召開。

大會合影(2013.8.24)A group photo of the international workshop (August 24, 2013)

2 會議學(xué)術(shù)交流的主要研究進(jìn)展

本屆學(xué)術(shù)會議共有來自12個國家的28位中外研究學(xué)者做了大會報(bào)告。其中，來自國外研究人員占大多數(shù)，共有19位。來自美國Robert A.Owens教授、丁守偉教授，中國的周雪平教授、西班牙Ricardo Flores教授、德國Detlev Riesner 教授等5位知名專家分別做了題為 “Why are viroids restricted to plant hosts: Current status of a long-standing conundrum”，“Development of next-generation technologies for the identification and discovery of viruses and viroids”，“Advances in understanding begomovirus satellites”，“Recent insights into viroids and viroid-host interactions”和“Potential mRNA targets of viroid-specific small RNA”的特邀報(bào)告，其余23位研究學(xué)者做了專題報(bào)告交流。報(bào)告內(nèi)容主要涉及新類病毒/環(huán)狀RNA分子的鑒定及其風(fēng)險(xiǎn)評估、類病毒及衛(wèi)星RNA侵染導(dǎo)致寄主的反應(yīng)、類病毒的遺傳多樣性和復(fù)制、類病毒的檢測技術(shù)及防治方法等4個方面。

2.1 新類病毒/環(huán)狀RNA分子的鑒定及其風(fēng)險(xiǎn)評估

類病毒是迄今為止已知的最小病原物，自20世紀(jì)六、七十年代被發(fā)現(xiàn)以來，世界上已經(jīng)報(bào)道了30多種。有趣的是，所有已發(fā)現(xiàn)的類病毒只侵染高等植物，而不侵染動物。對此，來自于類病毒發(fā)現(xiàn)者T.O.Diner實(shí)驗(yàn)室的國際知名教授Robert Owens提出了自己的見解。在對類病毒的發(fā)現(xiàn)及研究現(xiàn)狀進(jìn)行歸納總結(jié)的基礎(chǔ)上，他指出類病毒是通過胞間連絲進(jìn)行移動的，而動物的細(xì)胞間隙非常狹窄，類病毒可能無法通過，這可能是類病毒不能侵染動物的原因之一。當(dāng)然，沒有從動物中分離出類病毒也不能排除常用的檢測技術(shù)(PAGE，RT-PCR，Northern-blot等)還不夠靈敏這一可能，而高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)及其在病理學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用為驗(yàn)證這一猜測提供了強(qiáng)有力的手段。

來自美國的著名植物病理學(xué)家丁守偉教授針對“應(yīng)用高通量測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)新的病毒和類病毒”這一題目進(jìn)行了詳細(xì)的介紹。他在報(bào)告中指出，高通量測序結(jié)合生物信息學(xué)分析，是一種能夠發(fā)現(xiàn)新病毒/類病毒及其新株系的新技術(shù)。病毒/類病毒侵染寄主后，在RNA沉默介導(dǎo)的寄主防衛(wèi)反應(yīng)的作用下，會產(chǎn)生大量的來自于病毒/類病毒基因組的小干擾RNA (small interfere RNAs，siRNA)。這些siRNA能夠覆蓋病毒/類病毒的整個基因組，而且不同位置處的siRNA之間能夠相互重疊(overlap)。因此，通過從頭拼接siRNA應(yīng)該能夠獲得病毒/類病毒的基因組全序列或者部分片段(contig)的序列，BLAST分析拼接出的序列就可以鑒定出侵染寄主的病毒/類病毒[1-3]。應(yīng)用這一策略丁教授的課題組從果蠅(Drosophila) 的細(xì)胞和蚊子體內(nèi)鑒定出了一些之前未曾報(bào)道過的病毒[4]。利用高通量測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)病毒的前提是已知病毒的基因組序列，對于發(fā)現(xiàn)序列未知的新病毒還是一個很大的挑戰(zhàn)，但是對于新類病毒的發(fā)現(xiàn)來說則可以不依賴于序列的同源性。丁教授為大家介紹了一種能夠不依賴于已知序列信息而發(fā)現(xiàn)和鑒定新環(huán)狀RNA分子(如類病毒)的生物信息學(xué)程序—Progressive Filtering of Overlapping Small RNAs (PFOR)。丁教授的研究團(tuán)隊(duì)?wèi)?yīng)用該程序從葡萄中鑒定出一種新的具有核酶活性的環(huán)狀RNA分子—GHVd，推測該環(huán)狀RNA分子可能是一種新的類病毒[5]。

PFOR程序?yàn)榘l(fā)現(xiàn)更多新的類病毒或者環(huán)狀RNA分子提供了可能。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所李世訪研究員帶領(lǐng)的團(tuán)隊(duì)利用高通量測序技術(shù)結(jié)合PFOR分析技術(shù)從新疆一株老葡萄樹中和煙臺的蘋果樹中分別鑒定出一種新的環(huán)狀RNA分子。葡萄中的環(huán)狀RNA分子大小為328 nt，該分子與柑橘類病毒Ⅵ (CitrusviroidⅥ，CVd-Ⅵ)具有約70%的序列相似性，并且具有一致的中央保守區(qū)(central conserved region，CCR)，推測其可能是一種新的類病毒。從蘋果中分離出的新環(huán)狀RNA分子大小為434 nt，序列多樣性較高，而且其正負(fù)鏈均具有核酶活性(待發(fā)表)。

雖然具有靈敏度高、無檢測偏好性等優(yōu)點(diǎn)的高通量測序技術(shù)在植物病毒及類病毒檢測及鑒定方面具有廣闊的應(yīng)用前景[6]，但是，目前高通量測序的成本仍然比較高，并且數(shù)據(jù)的分析和處理要求研究人員具有較高的生物信息學(xué)分析技術(shù)，這使得傳統(tǒng)的成本相對較低的分離、鑒定和檢測技術(shù)仍然具有不可替代的作用。應(yīng)用PAGE、RT-PCR等傳統(tǒng)的技術(shù)，分離鑒定新的類病毒、鑒定類病毒的新寄主、監(jiān)測類病毒的發(fā)生和流行依然是類病毒研究領(lǐng)域的重要內(nèi)容。

來自西班牙的類病毒專家Ricardo Flores教授應(yīng)用Return-PAGE和s-PAGE技術(shù)從大麗花中鑒定出一種新的類病毒-大麗花潛隱類病毒(Dahlialatentviroid， DLVd)。這一新類病毒的RNA分子大小為342 nt，與其他已知病毒的序列相似性低于56%。其基因組能夠折疊成棒狀的二級結(jié)構(gòu)，且能夠形成亞穩(wěn)定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)Ⅰ和Ⅱ (Hairpin Ⅰ，Ⅱ)以及啤酒花矮化類病毒屬(Hostuviroid)的CCR結(jié)構(gòu)域，但與啤酒花矮化類病毒(Hopstuntviroid，HSVd)不同，DLVd并沒有末端保守的發(fā)夾結(jié)構(gòu)(terminal conserved hairpin，TCH)，而是含有馬鈴薯紡錘塊莖類病毒屬(Pospiviroid)的末端保守區(qū)(terminal conserved region，TCR)。這表明DLVd可能是由Hostuviroid和Pospiviroid重組形成的新種。雖然DLVd與Pospiviroid的辣椒小果類病毒(Pepperchatfruitviroid，PCFVd)的親緣關(guān)系最接近，但是它們的寄主范圍截然不同。DLVd的寄主范圍相對較窄，到目前為止，發(fā)現(xiàn)其只侵染大麗花。因此，其分類地位有待進(jìn)一步的研究[7]。

提及類病毒病害，不得不說的是椰子死亡病。該病害曾經(jīng)對菲律賓的椰子種植業(yè)造成幾乎毀滅性的打擊[8]。該病由椰子死亡類病毒(Coconutcadang-cadangviroid，CCCVd)引起[9]。CCCVd主要侵染棕櫚科植物。2006和2013年間，馬來西亞學(xué)者從馬來西亞棕櫚上也首次分離到CCCVd[10]，該分離物與CCCVd油棕分離物相似性為100%，能在椰子樹葉片上引起不規(guī)則的橙色斑點(diǎn)，而其致病機(jī)制還有待于進(jìn)一步的研究。目前，已有多個國家和機(jī)構(gòu)將CCCVd列為檢疫性有害生物。來自澳大利亞的Randles教授系統(tǒng)介紹了CCCVd的發(fā)生分布、寄主范圍、傳播方式，對其侵染循環(huán)過程中各種可能的相關(guān)因素以及油棕作為研究CCCVd模式寄主植物的可能性進(jìn)行了探討。隨著椰子樹全基因組序列的測定和高通量測序技術(shù)的不斷發(fā)展，熱帶單子葉植物中可能會發(fā)現(xiàn)新的類病毒，而類病毒在這些熱帶單子葉植物中的序列特異性及作用位點(diǎn)也將被揭示。

椰子死亡病的危害大，主要集中發(fā)生于菲律賓和馬來西亞等東南亞國家。與椰子死亡病相比較，番茄上的類病毒病害發(fā)生的范圍更廣。番茄能夠被多種類病毒侵染[11-12]，其中，由番茄褪綠矮縮類病毒(Tomatochloroticdwarfviroid，TCDVd)引起的番茄褪綠矮縮病是嚴(yán)重威脅番茄生產(chǎn)的病害之一。目前，歐洲、美洲以及亞洲一些國家已經(jīng)報(bào)道了TCDVd的發(fā)生[11，13-14]。因此，系統(tǒng)開展番茄類病毒病害的研究對保障番茄產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。美國的凌開樹教授團(tuán)隊(duì)主要從事番茄類病毒病害相關(guān)的基礎(chǔ)與應(yīng)用研究。他主要介紹了北美洲(主要是加拿大)溫室中栽培番茄病毒及類病毒病害。RT-PCR檢測結(jié)果表明：番茄上廣泛存在的類病毒有：馬鈴薯紡錘塊莖類病毒(Potatospindletuberviroid，PSTVd)[15]、番茄褪綠矮縮類病毒(Tomatochloroticdwarfviroid，TCDVd)[16-17]和墨西哥心葉茄類病毒(Mexicanpapitaviroid，MPVd)[17-18]，并對這3種類病毒的檢測手段、傳播方式、基因多樣性以及侵染不同寄主后引起的癥狀差異等方面進(jìn)行了詳細(xì)的討論。最后，還對轉(zhuǎn)基因技術(shù)、基因沉默等在類病毒與寄主互作方面的研究工作進(jìn)行了展望。

目前，我國的類病毒病害比較嚴(yán)重的是蘋果上發(fā)生的類病毒病。蘋果凹果類病毒(Appledimplefruitviroid，ADFVd)是馬鈴薯紡錘塊莖類病毒科(Pospiviroidae)蘋果銹果類病毒屬(Apscaviroid)的成員，能在蘋果上引起典型的凹果病癥，主要發(fā)生在意大利、黎巴嫩和日本[19-20]。中國農(nóng)業(yè)大學(xué)周濤等研究學(xué)者利用斑點(diǎn)雜交、RT-PCR等分子生物學(xué)方法首次在中國地區(qū)的蘋果樣品中檢測到了ADFVd，并對其分子生物學(xué)特性進(jìn)行了分析。對中國和意大利的ADFVd分離物進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析，結(jié)果顯示：ADFVd的序列多樣性具有明顯的地域差異性(待發(fā)表)。

葡萄黃痘類病毒1(Grapevineyellowspindleviroid-1，GYSVd-1)在澳大利亞地區(qū)的葡萄上廣泛發(fā)生[21]，來自澳大利亞的Randles教授介紹了一種可以從葡萄酒中提取RNA的方法，并利用該方法證實(shí)GYSVd-1、GYSVd-2和葡萄莖痘伴隨病毒(Grapevinerootstockstemlesionassociatedvirus，GRSPaV)的RNA分子能夠歷經(jīng)葡萄酒發(fā)酵工藝而留存下來，對不同葡萄酒中cDNA的深度分析可能會鑒定出更多的類病毒和病毒(結(jié)果尚未發(fā)表)。

PSTVd已經(jīng)被多個國家列為有害生物檢驗(yàn)檢疫對象，來自歐洲食品安全局(EFSA)的意大利學(xué)者Stancanelli詳細(xì)介紹了PSTVd等9種類病毒被歐盟列為有害生物檢驗(yàn)檢疫對象的原因和流程。首先，EFSA的植物衛(wèi)生(PLH)科學(xué)小組對植物上的有害生物進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評估，包括寄主范圍、傳播方式、對其他植物的潛在威脅等生物學(xué)特性和流行病學(xué)特征等，根據(jù)評價結(jié)果向歐盟委員會建議是否列為檢驗(yàn)檢疫性病害。在世界貿(mào)易組織關(guān)于衛(wèi)生和植物檢疫措施應(yīng)用協(xié)定的基礎(chǔ)上，歐盟委員會根據(jù)聯(lián)合國糧食與農(nóng)業(yè)組織(FAO)國際植物保護(hù)公約(IPPC)細(xì)則制定或修改植物檢疫規(guī)章制度。

2.2 類病毒及衛(wèi)星RNA侵染導(dǎo)致的寄主反應(yīng)

除了發(fā)現(xiàn)和鑒定新的類病毒外，對致病機(jī)制的解析也是類病毒研究領(lǐng)域重要的問題之一。雖然類病毒不能編碼任何多肽或蛋白，但是能夠成功地侵入寄主，并且在寄主體內(nèi)完成自我復(fù)制，建立起系統(tǒng)侵染，而且在一些作物上還能夠引發(fā)明顯的病癥。毫無疑問，類病毒的這些生物學(xué)功能的實(shí)現(xiàn)必然要依賴于寄主的某些蛋白質(zhì)或者其他因子。即：類病毒的RNA分子能夠與寄主的一些蛋白質(zhì)或者其他因子相互作用，這一相互作用可能引發(fā)寄主的信號傳導(dǎo)、基因表達(dá)及代謝途徑等的變化，從而引發(fā)癥狀的表現(xiàn)[22-23]。此外，類病毒也可能通過RNA沉默作用來影響寄主基因的表達(dá)[24-25]。研究RNA沉默在類病毒致病過程中的作用機(jī)制也是目前類病毒研究的熱點(diǎn)之一。本屆學(xué)術(shù)會議有幾位研究人員圍繞著這一問題做了詳細(xì)的報(bào)告。

Ricardo Flores教授以PSTVd為例，講述了可能參與類病毒與寄主互作的AGO蛋白以及類病毒的不同結(jié)構(gòu)在與寄主互作中的可能作用。來自德國的Riesner教授同樣以PSTVd為例，講述了PSTVd二級結(jié)構(gòu)中不同結(jié)構(gòu)域內(nèi)的各種Loop結(jié)構(gòu)在PSTVd復(fù)制過程中的作用，并闡述了致病區(qū)(pathogenicity region，P)的核苷酸在侵染過程中產(chǎn)生類病毒特異的小RNA(sRNA)，通RNA沉默作用干擾寄主mRNA的表達(dá)而致病[26]。

來自意大利的Di Serio教授以桃潛隱花葉類病毒(Peachlatentmosaicviroid，PLMVd)為例，介紹了如何利用高通量測序方法研究類病毒來源的sRNA在致病中的作用，研究類病毒與寄主的互作關(guān)系。其研究結(jié)果表明：PLMVd來源的sRNA靶向于寄主植物的mRNA分子，為“類病毒來源的sRNA可以靶向作用于寄主的mRNA分子使其降解/沉默，從而引起植物病癥”這一理論假設(shè)提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù)[27]。

來自西班牙的研究學(xué)者Gomez以啤酒花矮化類病毒(Hopstuntviroid，HSVd)與其寄主植物黃瓜為例，通過試驗(yàn)證明了在感染HSVd的黃瓜植株內(nèi)，累積了大量核糖體RNA(rRNA)的前體及核糖體來源的sRNA，而且HSVd的侵染導(dǎo)致黃瓜核糖體DNA甲基化的改變，因此HSVd侵染寄主后可能通過參與寄主植物體內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的方式引起植物病癥。從而為“類病毒來源的sRNA可能是作為植物病癥的誘發(fā)子參與介導(dǎo)了寄主內(nèi)源性mRNA降解”這一理論假設(shè)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)[28]。

來自加拿大的研究學(xué)者Adkar-Purushothama將PSTVd的強(qiáng)毒株系和弱毒株系分別接種到番茄上后，對接種后植株中的sRNA和miRNA進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)類病毒來源的sRNA在PSTVd弱毒株系侵染的植株中數(shù)量較少，類病毒的侵染能夠影響寄主植物體內(nèi)特定miRNA的數(shù)量，而且能夠靶向DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂相關(guān)的基因(待發(fā)表)。

日本著名類病毒研究學(xué)者Teruo Sano教授一直致力于HSVd與啤酒花的互作機(jī)制研究。經(jīng)過長時間的接種試驗(yàn)，源自葡萄的HSVd分離物在啤酒花上持續(xù)侵染的過程中發(fā)生了5個堿基的變異，演變?yōu)楝F(xiàn)在的HSVd-啤酒花分離物，此分離物對葡萄和黃瓜的侵染力下降，這可能是HSVd進(jìn)化過程中的取舍效應(yīng)(trade-off)，以利于HSVd-啤酒花分離物在啤酒花上存活。HSVd啤酒花分離物上的部分堿基變異能夠使HSVd逃脫寄主植物基因沉默介導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)(待發(fā)表)。

植物病毒衛(wèi)星是指依賴于植物病毒進(jìn)行復(fù)制的核酸分子。在植物RNA病毒中，小分子核酸(如衛(wèi)星RNA)廣泛存在，但直到1997 年，衛(wèi)星DNA才從澳大利亞番茄曲葉病毒(ToLCV)感染的病株中分離到?；蚪M為單鏈環(huán)狀DNA的雙生病毒在世界范圍內(nèi)廣泛發(fā)生，而且在多種重要的經(jīng)濟(jì)作物上引起嚴(yán)重危害。來自浙江大學(xué)的周雪平教授對雙生病毒科Begomovirus病毒屬病毒及其衛(wèi)星DNA分子的研究進(jìn)展進(jìn)行了總結(jié)，指出單組分雙生病毒常伴隨衛(wèi)星DNA分子(DNAα/DNAβ)。DNAβ是單組分雙生病毒誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生典型癥狀所必需的致病決定因子，并與輔助病毒構(gòu)成雙生病毒DNAβ病害復(fù)合體，進(jìn)一步加重危害。同時，所有的DNAβ在其互補(bǔ)鏈上都編碼一個保守的βC1開放閱讀框。研究表明：βC1蛋白可以抑制寄主的茉莉酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，并且可以作為RNA沉默抑制子抑制寄主的RNA沉默防御反應(yīng)。此外，DNAα通常與DNAβ同時出現(xiàn)，DNAα是致病非必需的，具體功能還有待進(jìn)一步的研究。現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展將有助于發(fā)現(xiàn)新的雙生病毒及其衛(wèi)星病毒，也將有助于進(jìn)一步理解衛(wèi)星DNA分子的全球多樣性及其與輔助病毒之間的進(jìn)化關(guān)系。

病毒衛(wèi)星RNA分子依賴其輔助病毒進(jìn)行復(fù)制、蛋白包裹、移動和傳播，而它們也在不同程度上影響輔助病毒的致病性。西南大學(xué)申晚霞博士利用本氏煙在感染黃瓜花葉病毒(CMV)強(qiáng)、弱兩株系(Fny-CMV，Q-CMV)以及有無衛(wèi)星RNA(Y-sat RNA)處理下miR168的表達(dá)量，分析了病毒的沉默抑制子(VSR)和Y-sat RNA之間的相互關(guān)系。其研究結(jié)果驗(yàn)證了Y-sat RNA能夠減輕其輔助病毒在煙草上引起的癥狀的假說(待發(fā)表)。

2.3 類病毒的復(fù)制及基因多樣性

在長期的進(jìn)化過程中，類病毒的種群結(jié)構(gòu)因突變的發(fā)生而不斷變化，但所有類病毒的種群結(jié)構(gòu)均符合“準(zhǔn)種”模式，這種結(jié)構(gòu)對類病毒的致病性和進(jìn)化具有重要影響。

類病毒結(jié)構(gòu)簡單，不編碼蛋白，通過RNA在寄主中的自我復(fù)制完成其全部的生物學(xué)功能，因此，類病毒可用于研究RNA復(fù)制及系統(tǒng)侵染過程中RNA結(jié)構(gòu)變異的作用。來自波蘭的Wiesyk對PSTVd可變區(qū)(V區(qū))的堿基進(jìn)行突變后接種番茄，對其子代序列的分析結(jié)果表明：PSTVd在進(jìn)化過程中不斷地發(fā)生變異；V區(qū)部分堿基變異會影響PSTVd的侵染和癥狀表達(dá)；V區(qū)堿基變異時PSTVd會進(jìn)行回復(fù)突變或者自動調(diào)整其他位置序列使其結(jié)構(gòu)最優(yōu)化以利于PSTVd的復(fù)制和侵染；PSTVd在番茄根莖中的基因穩(wěn)定性高于葉片。

桃潛隱花葉類病毒(PLMVd)是桃樹上廣泛存在的一種類病毒，能夠?qū)е绿覙鋲勖s短，對其他病害敏感，果品質(zhì)量下降等。來自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)的徐文興博士對3種不同癥狀桃樹上的PLMVd進(jìn)行了序列多樣性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：每個PLMVd都遵循“準(zhǔn)種”模式，主流序列占序列總數(shù)的41%～50%。構(gòu)建主流序列的侵染性克隆，經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄接種不同的桃樹無毒苗，證明了PLMVd上第338位堿基變異是桃樹葉片黃化和萎黃的病因，同時也證明了PLMVd的致病區(qū)位于其二級結(jié)構(gòu)上的第11個Loop(L11)內(nèi)[29]。

類病毒通過滾環(huán)模式進(jìn)行復(fù)制，由于自身不能編碼任何蛋白，類病毒需要在寄主因子的參與下由線狀分子環(huán)化成為環(huán)狀RNA分子。來自西班牙的研究學(xué)者Daros對類病毒RNA自我環(huán)化反應(yīng)過程中的連接酶進(jìn)行了深入研究，一方面，通過試驗(yàn)證明了番茄中的DNA連接酶Ⅰ可作為RNA連接酶催化PSTVd的環(huán)化反應(yīng)；另一方面，還通過試驗(yàn)證明了茄子中的tRNA連接酶能夠催化鱷梨日斑類病毒科(Avsunviroidae)所有4種類病毒的自我環(huán)化反應(yīng)[30]。

目前為止，已有24個國家報(bào)道了菊花矮化類病毒(CSVd)，其中16個國家報(bào)道了CSVd的序列[31]。來自韓國的研究學(xué)者Ju-Yeon Yoon對目前已報(bào)道的117個CSVd分離物進(jìn)行了序列多樣性分析，結(jié)果表明：多個國家的CSVd分離物序列相似，117個CSVd分離物的序列分為80種，各序列間相似性大約為95.5%～100%之間，CSVd序列無明顯的地區(qū)差異性[32]。

柑橘矮化類病毒(CDVd)是柑橘矮化病的病原，來自意大利的研究學(xué)者Tessitori將自然界中分離到的CDVd分離物接種不同品種的柑橘，通過分析其子代序列的多樣性，證明了不同的寄主對CDVd的進(jìn)化及子代序列多樣性起重要作用[33]。

2.4 類病毒的檢測方法與防治技術(shù)

類病毒具有極高的穩(wěn)定性，且傳染性強(qiáng)，建立快速、靈敏、準(zhǔn)確、有效的檢測方法，不僅能夠快速發(fā)現(xiàn)病原，降低檢測成本，省時省力，還將有助于快速調(diào)查類病毒的發(fā)生分布情況，對類病毒的防治具有重要意義。

2007年，中國將馬鈴薯紡錘塊莖類病毒(PSTVd)列為檢疫性有害生物，從種苗到大田種薯以及商品薯的質(zhì)量安全普查結(jié)果顯示，PSTVd已經(jīng)廣泛存在于中國的馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)，并且呈現(xiàn)上升的趨勢，部分地塊馬鈴薯類病毒侵染率高達(dá)80%[34-35]。來自黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院的研究學(xué)者呂典秋帶領(lǐng)的團(tuán)隊(duì)研發(fā)了一種靈敏度高、可用于快速檢測PSTVd的核酸斑點(diǎn)雜交(NASH)試劑盒[36]，介紹了PSTVd的防治方法，并詳細(xì)講述了RNA干擾技術(shù)在防治PSTVd病害方面的研究進(jìn)展。

PSTVd能夠侵染多種重要作物，且在水中能存活達(dá)一個月之久。來自斯洛文尼亞的研究學(xué)者Ravnikar建立了一種逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(RT-LAMP)方法[37]，可以從植株的不同部位(包括莖、葉片、種子等)檢測PSTVd，該方法靈敏度高、成本低，取樣不受時空限制，30 min內(nèi)即可完成檢測。其建立的CIM濃縮法有助于追蹤類病毒在水中的傳播途徑，具有流行病學(xué)意義。

椰子死亡類病毒(CCCVd)曾導(dǎo)致菲律賓的椰子大量死亡，馬來西亞的棕櫚中也發(fā)現(xiàn)了CCCVd，但是濃度極低，因此傳統(tǒng)的分子生物學(xué)方法并不適用，來自馬來西亞的研究學(xué)者Sathis建立了一種快速有效的基于SYBR-green染料的實(shí)時熒光定量PCR檢測方法，可以檢測到棕櫚中濃度極低的CCCVd(待發(fā)表)。

來自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所的姜冬梅博士介紹了錦紫蘇類病毒(CbVds)在中國的發(fā)生分布情況，建立了兩種CbVds快速檢測方法[38-39]：Sap-direct RT-PCR法和通用探針快速雜交法。Sap-direct RT-PCR法中，利用移液器直接吸取錦紫蘇莖和葉的汁液作為RT-PCR的模板，通過一次PCR就可以確定被檢植株是否感染了CbVds以及感染類病毒的種類。通用探針快速雜交法中，8CCR探針可以通過斑點(diǎn)雜交一次性確定樣品中是否攜帶CbVds，通過Northern雜交技術(shù)可以一次性確定樣品中感染CbVds的種類。這兩種快速檢測方法簡單高效，成本較低，適用于CbVds的批量檢測及大規(guī)模調(diào)查，對其他類病毒，甚至病毒快速檢測方法的建立也具有借鑒意義。

北京出入境檢驗(yàn)檢疫局鄧叢良博士以葡萄上的5種類病毒為例，介紹了利用納米磁珠技術(shù)檢測植物類病毒的方法[40-41]。該方法10 min內(nèi)即可完成類病毒核酸的提取，與同類植物RNA提取試劑盒相比，具有操作簡單、快捷、穩(wěn)定的特點(diǎn)，并且其檢測類病毒的靈敏度比同類植物RNA提取試劑盒高10到100倍。

CSVd屬于馬鈴薯塊莖類病毒科(Pospiviroidae)，是菊花上廣泛存在的一種類病毒?！甕ellow Empire’品種的菊花是挪威的一種重要觀賞植物，CSVd能夠嚴(yán)重影響該品種菊花的觀賞價值和經(jīng)濟(jì)價值。西北農(nóng)林科技大學(xué)的張智博博士生介紹了一種利用冷凍處理方法去除CSVd的脫毒技術(shù)。感染CSVd的植物材料在低溫環(huán)境中保持一段時間后，其感染CSVd的植物細(xì)胞明顯減少，低溫處理與莖尖培養(yǎng)相結(jié)合可能會對感染CSVd的菊花進(jìn)行有效的脫毒(待發(fā)表)。

3 結(jié)束語

“國際類病毒及衛(wèi)星病毒學(xué)術(shù)研討會”是類病毒及衛(wèi)星病毒研究領(lǐng)域的首次全球性國際學(xué)術(shù)會議，本次大會收獲不少，得到同行專家的極大關(guān)注和重視，聚集了許多該研究領(lǐng)域的國際知名專家，傳遞了類病毒及衛(wèi)星病毒相關(guān)研究的最新進(jìn)展，為廣大科技工作者提供了較高水平的國際交流與合作的平臺。同時，大會在北京成功召開，提高了中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所科研團(tuán)隊(duì)在該研究領(lǐng)域的地位和聲望，積累了許多組織國際會議的工作經(jīng)驗(yàn)，為本團(tuán)隊(duì)研究生提供了志愿者鍛煉的機(jī)會。最后，“國際類病毒及衛(wèi)星病毒學(xué)術(shù)研討會”組委會衷心感謝對大會給予大力支持的科研院所、高等院校、學(xué)會等有關(guān)單位和會議全體工作人員以及志愿者和所有參會代表。

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Overviewandmainresearchprogressof“InternationalWorkshoponViroidsandSatelliteRNAs(IWVdS)”

Lu Meiguang，Jiang Dongmei，Zhang Zhixiang，Li Shifang

(InstituteofPlantProtection,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193,China)

The purpose of this paper is to share experiences on how we held the “International Workshop on Viroids and Satellite RNAs” (IWVdS) and summarize the main research progresses and highlights of the plenary lectures on four sessions, including “Identification and Characterization of New/Emerging Viroids/viroid-like RNAs and Risk Assessment”, “Plant Responses to Viroids and Satellite RNA’s Infections”, “Genetic Diversity and Replication of Viroids” and “Detection Methods and Control of Viroids”.We hope that it is helpful to the related scientific researchers.

viroid； satellite RNAs； international workshop； main research progress

2013-11-17

： 2013-11-19

國家自然科學(xué)基金國際(地區(qū))合作與交流項(xiàng)目(在華召開國際(地區(qū))學(xué)術(shù)會議)(31310303047)；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201203076)

S 432.41

： ADOI： 10.3969/j.issn.0529-1542.2014.01.004

* 通信作者 E-mail:sfli@ippcaas.cn