李建國 張紅杰 李海龍 杜 芳

(天津科技大學(xué)天津市制漿造紙重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津，300457)

纖維的表面形態(tài)是纖維性質(zhì)的重要組成部分，對纖維本身以及纖維制品的性能有決定性的影響，決定著纖維間的結(jié)合以及纖維對化學(xué)助劑的吸附。隨著表面分析技術(shù)的發(fā)展和現(xiàn)代科學(xué)儀器的普及，科研工作者開始把焦點(diǎn)轉(zhuǎn)移到纖維的微觀形態(tài)上。如利用原子力顯微鏡 (AFM)和X-射線光電子能譜 (XPS)研究纖維表面木素的含量和分布，利用透射電子顯微鏡(TEM)觀察陽離子改性后納米微晶纖維素的再分散情況，利用掃描電子顯微鏡 (SEM)觀察纖維表面的形貌，利用二次離子質(zhì)譜儀 (SIMS)檢測微量元素在纖維上的空間分布，利用共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM)分析纖維細(xì)胞壁中木素的分布情況等。

CLSM最初用于快速無損傷地獲得細(xì)胞的三維圖像。近年來，已開始在制漿造紙行業(yè)中用于纖維表面性能的研究。CLSM不同于傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡(LM)，它是光學(xué)顯微鏡與現(xiàn)代激光技術(shù)、高靈敏探測技術(shù)、掃描控制技術(shù)、微機(jī)圖像處理技術(shù)、熒光及標(biāo)記技術(shù)的有機(jī)結(jié)合［1］。CLSM的基本原理是基于共聚焦技術(shù)和數(shù)字圖像處理技術(shù)，其最大的優(yōu)勢在于能夠產(chǎn)生無損傷的“光學(xué)切片”，快速地檢測透明及半透明的樣品 (如木纖維)［2］。借助于激光束的掃描作用，CLSM能夠在自然環(huán)境下對物體表面進(jìn)行無損傷探測，具有獨(dú)特的縱向分辨率和較高的橫向分辨率，能夠?qū)崿F(xiàn)多重?zé)晒獾耐瑫r(shí)觀察檢測。

1 共聚焦激光掃描顯微鏡

與傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡不同，CLSM采用激光照射樣品的某一點(diǎn)并同時(shí)成像。受衍射控制的激光光點(diǎn)的尺寸決定了圖像的分辨率，因此，CLSM比傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡有更高的橫向 (XY向)分辨率，同時(shí)可用數(shù)字圖像處理技術(shù)改善圖像的信噪比 (S/N)和對比度。

CLSM最大的特點(diǎn)是可以提供“光學(xué)切片”。激光透過物鏡形成共聚焦平面，共聚焦平面以外的大部分散射光、反射光或熒光都被針孔過濾掉，不會(huì)進(jìn)入光電檢測器，其成像示意圖見圖1。如果物體比較厚，則只有一個(gè)薄層可以形成清晰的圖像，即樣品橫截面的二維圖像，且針孔的過濾作用確保了圖像的信息只來源于該薄層，同時(shí)“光學(xué)切片”對樣品本身不會(huì)造成任何損傷。利用CLSM自帶的軟件，把一系列的二維圖像疊加起來，通過重組即可得到物體的三維圖像［3］。

圖1 CLSM的成像示意圖［4］

CLSM圖像的基本模型是XY平面，或樣品共聚焦面的截面。CLSM和LM的區(qū)別是:CLSM只接收共聚焦平面的信號(hào)，因此，得到的圖像僅是一個(gè)平面，而不是樣品物體的全部，但LM鏡頭內(nèi)物體表面反饋的全部信號(hào)都能被接收到。CLSM通過變換沿著高度方向上的共聚焦平面，可以得到一系列的共聚焦圖像，即所謂的“光學(xué)切片”，如圖2(a)所示。借助于軟件，這些“光學(xué)切片”被疊加起來，就可以重組物體的三維圖像，如圖2(b)所示。同樣，CLSM也可掃描XZ或YZ平面。當(dāng)掃描XZ平面時(shí)，可以得到沿著纖維方向上的橫切面，如圖3(a)所示;當(dāng)掃描YZ平面時(shí)，可以得到纖維的橫截面，如圖 3(b)所示［5］。

圖2 桉木BCTMP漿纖維的CLSM圖［5］

圖3 纖維橫切面的CLSM圖

作為一種熒光檢測手段，CLSM觀測時(shí)需要對樣品進(jìn)行熒光染色。其主要的制樣步驟如下:①配制染色劑溶液;②在避光狀態(tài)下對樣品進(jìn)行充分染色;③洗掉樣品表面的浮色;④制備樣品玻片，即可進(jìn)行觀察檢測。在避光保存的條件下，樣品玻片可以重復(fù)使用。

從20世紀(jì)80年代至今，CLSM的類型和功能不斷更新，已經(jīng)出現(xiàn)了一系列的CLSM，如視屏CLSM、雙光子CLSM、4Pi共聚焦激光顯微鏡、多焦點(diǎn)多光子共聚焦激光顯微鏡等。本文主要圍繞傳統(tǒng)CLSM在纖維形態(tài)和紙張結(jié)構(gòu)研究中的應(yīng)用展開論述。

2 共聚焦激光掃描顯微鏡的應(yīng)用

2.1 纖維的形態(tài)

紙漿纖維的形態(tài)主要包括纖維的長度、寬度、粗度、細(xì)胞壁厚度和壁腔比等指標(biāo)。這些參數(shù)是評價(jià)纖維品質(zhì)的重要依據(jù)，纖維品質(zhì)的好壞不僅影響紙漿的品質(zhì)，還直接關(guān)系到成品紙張的品質(zhì)［6］。纖維長度和粗度對紙張的抗張強(qiáng)度、撕裂強(qiáng)度和耐破度有重要影響。纖維細(xì)胞的壁腔比對紙張性能的影響極大:細(xì)胞壁較厚的纖維不易打漿，纖維間的結(jié)合較差，形成的紙張物理強(qiáng)度性能較弱，但紙張的松厚度高，吸水性好;細(xì)胞壁薄而細(xì)胞腔大的纖維比較柔軟，容易壓潰，可以抄造出強(qiáng)度較高、緊度較大的紙張。運(yùn)用CLSM技術(shù)進(jìn)行纖維形態(tài)觀測時(shí)，首先需要對纖維樣品進(jìn)行熒光染色，待熒光染料吸附到纖維表面上后洗掉多余染料，然后把樣品放在載物臺(tái)上觀察即可［7］。利用“光學(xué)切片”和圖像分析技術(shù)可以分析纖維的長度、橫截面積和細(xì)胞壁厚度等，如圖2(b)所示。

Jang等人［4］利用CLSM得到了未漂硫酸鹽針葉木漿纖維和微球體橫截面的熒光圖像。結(jié)果表明，利用CLSM技術(shù)可以對樣品的橫截面積進(jìn)行定量的測量;采用微量的吖啶橙 (AO)染色可以獲得最佳的纖維共聚焦圖像;結(jié)合共聚焦技術(shù)和圖像分析技術(shù)可以測定紙漿中纖維橫截面積的大小和纖維粗度的分布。丁上駿［8］運(yùn)用CLSM技術(shù)觀測化學(xué)機(jī)械漿纖維表面形態(tài)，指出打漿增加了細(xì)小纖維和纖維碎片的含量，纖維細(xì)胞壁的P層、S層逐漸被破除，纖維的長度和粗度均下降，而纖維的柔軟可塑性增加。YAN等人［9］利用ImageJ軟件把纖維橫截面的CLSM圖像進(jìn)行二值化處理，得到了纖維長度、粗度和細(xì)胞壁厚度的數(shù)據(jù)，進(jìn)而用于分析紙漿纖維的成紙性能。

2.2 纖維表面的木素

植物纖維原料主要由纖維素、半纖維素和木素組成。在制漿過程中，利用化學(xué)或機(jī)械的方法，使纖維彼此分離。化學(xué)漿和化學(xué)機(jī)械漿有本質(zhì)的區(qū)別，化學(xué)機(jī)械漿的纖維中仍保留大量的木素，對纖維本身的性能和紙漿整體質(zhì)量均有負(fù)面影響，因?yàn)槟舅啬軌蚪档屠w維的可再濕性、柔韌性和潤脹性能，阻礙纖維間的結(jié)合以及纖維和化學(xué)品之間的連接。Koljonen等人［10］指出木素和抽出物在纖維表面呈顆粒狀或薄膜狀分布，顆粒直徑的大小與制漿方法有關(guān)，而纖維素則呈微細(xì)纖維狀分布在纖維表面。

有研究表明［11］利用CLSM技術(shù)觀測纖維表面的木素，CTMP漿纖維表面分布著大量顆粒狀物質(zhì)，這些顆粒狀物質(zhì)是制漿后殘存的木素或者抽出物。不論是木素還是抽出物，都具有憎水性，會(huì)阻礙纖維間的結(jié)合，降低紙張強(qiáng)度。丁上駿［8］利用番紅 (Safranin O)對桉木CTMP漿纖維進(jìn)行染色，通過CLSM觀察打漿對纖維表面木素含量的影響。結(jié)果表明，隨著打漿轉(zhuǎn)數(shù)的增加，纖維整體和表面的熒光強(qiáng)度呈下降趨勢，即總木素和表面的木素含量下降，同時(shí)紙漿的抗張強(qiáng)度明顯提高。

當(dāng)纖維與纖維之間的結(jié)合形成纖維網(wǎng)絡(luò)時(shí)，首先是纖維的表面相互接觸，因此，纖維表面的化學(xué)成分對纖維間的結(jié)合有更重要的影響。木素作為憎水性物質(zhì)，覆蓋在纖維表面，阻隔纖維表面羥基之間的結(jié)合和氫鍵的形成，進(jìn)而降低纖維間的結(jié)合強(qiáng)度。王寶玉等人［12］結(jié)合AFM和CLSM分析纖維表面的木素，結(jié)果表明，如果CTMP漿纖維全部為纖維素，纖維與纖維之間的作用力即纖維素間的黏附力是28.7 mN/m;而當(dāng)CTMP漿纖維全部由木素構(gòu)成時(shí)，木素之間的黏附力僅為2.48 mN/m;纖維表面的木素濃度是纖維整體木素濃度的兩倍;內(nèi)部結(jié)合強(qiáng)度 (IBS)與纖維表面木素的濃度有線性關(guān)系，隨纖維表面木素覆蓋率的增加而降低。Li等人［13］利用CLSM定性分析了木素在纖維表面的分布，CLSM圖像表明未漂硫酸鹽楊木漿纖維表面的木素濃度是纖維整體木素濃度的2～3倍，而且木素在纖維表面分布不均勻，主要富集在纖維外表面、纖維壁內(nèi)表面和細(xì)胞壁孔洞中。

利用CLSM觀測纖維表面的木素時(shí)，通常需要添加不同的熒光染料，如吖啶橙、天青B、黃連素和孔雀綠等，其中吖啶橙熒光效果最佳［14-15］。丁上駿等人［8］用星藍(lán)和番紅分別標(biāo)記纖維上的纖維素和木素，結(jié)果表明，CTMP漿纖維中的纖維素主要集中在纖維內(nèi)部，而纖維細(xì)胞壁外表面以及細(xì)胞內(nèi)腔表面的木素含量都比細(xì)胞內(nèi)腔的高。同時(shí)也可以利用不同的熒光染料對不同的紙漿纖維進(jìn)行熒光染色，如圖4所示［16］。

圖4 漂白麥草漿和桉木高得率漿纖維分布的CLSM圖

2.3 纖維的形變性

在紙漿纖維的諸多特性中，纖維的柔韌性是纖維最重要且最基礎(chǔ)的一個(gè)性質(zhì)。在紙張成形過程中，纖維的柔韌性會(huì)影響纖維內(nèi)部的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，決定了紙張的大部分性質(zhì)，如紙張的松厚度、透氣度、不透明度、表面粗糙度和物理強(qiáng)度等［17］。Steadman等人［18］的研究指出，紙張的緊度和纖維的柔韌性有良好的線性關(guān)系，更重要的是當(dāng)纖維比較挺硬時(shí)，紙張的緊度隨纖維柔韌性的變化會(huì)更加敏感。因此如果利用機(jī)械漿代替硫酸鹽漿進(jìn)行生產(chǎn)，機(jī)械漿纖維的柔韌程度就變得尤為重要。機(jī)械漿的添加可以降低生產(chǎn)成本，提高紙張松厚度，但其較差的柔韌性會(huì)限制纖維之間的結(jié)合，容易導(dǎo)致紙張表面粗糙［19］。

纖維的柔韌性是影響纖維內(nèi)部結(jié)合強(qiáng)度的重要因素，決定著紙張的強(qiáng)度性能。Steadman等人［18］提出利用纖維的適應(yīng)性能可以評價(jià)纖維的柔韌性。Li等人［5］借助于CLSM對纖維的形變圖進(jìn)行掃描，如圖5所示。用數(shù)學(xué)軟件Matlab加工處理，通過低通濾波器使CLSM圖平滑化，最后轉(zhuǎn)化為二值化圖像，這樣既可以提高測量的精確度又避免了主觀誤差。由圖5可以看出，LM測量的是纖維和載玻片表面的接觸點(diǎn)到支撐線中心的距離L'，CLSM可以測量纖維中軸線的最低點(diǎn)到支撐線中心的距離L，且二者的測量結(jié)果相差較大。與化學(xué)漿纖維相比，機(jī)械漿纖維更加挺硬，纖維壁更厚，如果采用Steadman理論計(jì)算纖維的柔韌性，同時(shí)不能忽略機(jī)械漿細(xì)胞壁的厚度，那么需要測量的應(yīng)該是纖維中軸線最低點(diǎn)到支撐線中心的距離L。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CTMP漿纖維的柔韌性與纖維間的結(jié)合強(qiáng)度和紙張的抗張強(qiáng)度有很好的相關(guān)性，漂白和打漿可以增加纖維的柔韌性。

圖5 纖維橫截面的二值化圖

在紙張生產(chǎn)過程中，壓榨、干燥和壓光等操作會(huì)引起纖維形變最終導(dǎo)致纖維被壓潰。壓潰作用使纖維間的結(jié)合更加緊密，紙張的內(nèi)部結(jié)合強(qiáng)度更好，紙張的物理強(qiáng)度性能得到提高。壓榨導(dǎo)致纖維的變形分為兩種，一種是纖維的柔順性引起的彎曲形變，另一種則是由于壓潰作用而發(fā)生的剪切形變，通常剪切形變貢獻(xiàn)著纖維的大部分變形［20］。Li等人［5］利用 CLSM獲得纖維的橫截面圖，研究分析了不同紙漿纖維的壓潰能力 (見圖6)。由圖6可以看出，薄壁的云杉BKP漿纖維很容易發(fā)生完全的壓潰;即使經(jīng)過濕壓，厚壁的樺木BCTMP漿纖維也有部分的壓潰。另外，相比于化學(xué)機(jī)械漿，化學(xué)漿有更大的壓潰系數(shù)。

2.4 紙張結(jié)構(gòu)

紙張是一種多相、非均質(zhì)、非均勻分布且具有三維結(jié)構(gòu)的網(wǎng)狀物材料。在紙張Z向上，纖維、涂層、填料與孔隙的結(jié)構(gòu)和形態(tài)不同，這種差異會(huì)直接影響到紙張的最終性質(zhì)，如內(nèi)結(jié)合強(qiáng)度、光學(xué)性能以及油墨吸收性能等。纖維在紙張的縱向 (MD)、橫向(CD)以及厚度方向 (ZD)上存在著排列不均勻性，從而使紙張的物理性能呈三維異向性。紙張的三維多孔結(jié)構(gòu)直接決定了紙張的緊度和光學(xué)性能，通過相對結(jié)合面積 (RBA)間接決定了紙張的機(jī)械性能和尺寸穩(wěn)定性。紙張的內(nèi)部孔隙影響紙張的緊度、物理性能以及白度等;紙張的表面孔隙影響紙張的平滑度、涂布情況以及印刷性能等。

利用SEM觀察紙張橫截面的技術(shù)已經(jīng)相當(dāng)成熟，但是該技術(shù)需要對紙張進(jìn)行包埋切片處理，步驟繁瑣;利用CLSM的“光學(xué)切片”技術(shù)，不需對紙張進(jìn)行切片處理，制樣簡單，且不損傷樣品。Somwang等人［21］利用CLSM觀察細(xì)小纖維在紙張結(jié)構(gòu)中的分布，如圖7所示。結(jié)果表明，細(xì)小纖維不僅覆蓋在長級(jí)分纖維表面，還填充在長級(jí)分纖維結(jié)合的區(qū)域，可以進(jìn)一步提高紙張的結(jié)合強(qiáng)度。借助CLSM，Moss等人［22］也發(fā)現(xiàn)通過添加細(xì)小纖維可以提高長級(jí)分纖維手抄片的緊度和抗張強(qiáng)度。ZHANG等人［23］利用CLSM觀察到紙張表面涂布?xì)ぞ厶菍Ψ湎灊B透有明顯的阻礙效果，如圖8所示。Ozaki等人［24］借助于CLSM研究了涂布對印刷性能的影響以及油墨在紙張中的分布和滲透情況。

圖7 紙張結(jié)構(gòu)的XY截面圖和在點(diǎn)線處的XZ截面圖

圖8 紙張橫截面的CLSM圖［23］

圖6 不同纖維橫截面的CLSM圖

3 結(jié)語

基于激光共聚焦技術(shù)和圖像分析技術(shù)，采用共聚焦激光掃描顯微鏡 (CLSM)可以獲得樣品的“光學(xué)切片”且不損傷樣品，還可以直接給出樣品的三維圖像，具有很高的橫向 (XY向)分辨率和信噪比。借助于CLSM，可以更直觀地檢測纖維細(xì)胞壁的厚度和橫截面的面積，分析纖維表面木素的含量和分布，研究纖維的柔韌性能和壓潰性能，觀察紙張的表面和內(nèi)部結(jié)構(gòu)，探究涂料和油墨在紙張表面的分布和滲透情況。從長遠(yuǎn)來看，優(yōu)于傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的CLSM在纖維形態(tài)和紙張結(jié)構(gòu)的研究中將會(huì)有更廣泛的應(yīng)用。

［1］ XU Xian-feng，XU Xi-jin，HUO Xia．The technique of confocal laser scanning microscopy［J］．Acta Laser Biology Sinica，2003，12(2):156．許險(xiǎn)峰，徐錫金，霍 霞．共聚焦激光掃描顯微鏡技術(shù)［J］．激光生物學(xué)報(bào)，2003，12(2):156．

［2］ Jang H F，Robertson A G，Seth R S．Optical sectioning of pulp fibers using confocal scanning laser microscopy［J］．Tappi Journal，1991，74(10):217．

［3］ LI Ke-cheng，Reeve D W．Image wood pulp fibre surface lignin by fluorescence confocal laser scanning microscopy［C］//The International Papermaking and Environment Conference．Tianjin，China，2004．

［4］ Jang H F，Robertson A G，Seth R S．Transverse dimensions of wood pulp fibres by confocal laser scanning microscopy and image analysis［J］．Journal of Materials Science，1992，27(23):6391．

［5］ YAN Dong-bo，LI Ke-cheng．Measurement of wet fiber flexibility by confocal laser scanning microscopy［J］．Journal of Materials Science，2008，43(8):2869．

［6］ LI Jian-guo，ZHANG Hong-jie，LEI Ming，et al．The Characteristics of Various Fiber Fractions of P-RC APMP［J］．China Pulp ＆ Paper，2013，32(4):28．李建國，張紅杰，雷 鳴，等．P-RC APMP漿不同篩分級(jí)分的纖維特性和成紙性能［J］．中國造紙，2013，32(4):28．

［7］ Nanko H，Ohsawa J．Scanning laser microscopy of the drying process of wet webs［J］．Journal of Pulp and Paper Science，1990，16(1):6．

［8］ DING Shang-jun．The relation of the characteristic of the fiber surface and the intensity of the paper determined by CLSM［D］．Guangzhou:South China University of Technology，2010．丁上駿．用共聚焦激光掃面顯微鏡表征纖維表面化學(xué)特性與紙頁強(qiáng)度的關(guān)系［D］．廣州:華南理工大學(xué)，2010．

［9］ YAN Dong-bo，LI Ke-cheng．Wet fiber shear flexibility and its contribution to the overall transverse deformation of fibers［J］．Journal of Materials Science，2008，43(22):7210．

［10］ Koljonen K，osterberg M，Kleen M，et al．Precipitation of lignin and extractives on kraft pulp:effect on surface chemistry，surface morphology and paper strength［J］．Cellulose，2004，11(2):209．

［11］ WANG Bao-yu，LI Rong，HE Bei-hai，et al．The impacts of lignin coverage，relative bonded area， and fiber properties on sheet strength［J］．BioResources，2011，6(4):4356．

［12］ WANG Bao-yu，HE Bei-hai，LI Jun-rong．Study on lignin coverage of masson pine fiber［J］．BioResources，2010，5(3):1799．

［13］ LI Ke-cheng，Reeve D W．Analysis of lignin distribution across wood pulp fibre walls with confocal laser scanning microscopy［J］．Cellulose Chemistry and Technology，2005，39(3):211．

［14］ LIU Yue．Application of secondary fluorescence to measure the kappa number of single fibers［D］．Washington:University of Washington，1998．

［15］ Stockert J C，Canete M，Colman O D．Histochemical mechanism for the orthochromatic staining and fluorescence reaction of lignified tissues［J］．Cellular and Molecular Biology，1984，30(6):503．

［16］ ZHANG Hong-jie，LI Jian-guo，HU Hui-ren，et al．Improvement of bleached wheat straw pulp properties by using aspen high-yield pulp［J］．Bioresource Technology，2012，120:40．

［17］ LEI Ming，ZHANG Hong-jie，LI Jian-guo，et al．Characteristics of poplar preconditioning followed by refining chemical treatment alkaline peroxide mechanical pulp fiber fractions and their effects on formation and properties of high-yield pulp containing paper［J］．Industrial and Engineering Chemistry Research， 2013， 52(11):4083．

［18］ Steadman R．Luner P．The effect of wet fibre flexibility of sheet apparent density［C］//8th Fundamental Research Symposium．Oxford，UK，1981．

［19］ LI Ke-cheng，TAN Xue-quan，YAN Dong-bo．The middle lamella remainders on the surface of various mechanical pulp fibres［J］．Surface and Interface Analysis，2006，38(10):1328．

［20］ Waterhouse J F，Page D H．The contribution of transverse shear to wet fiber deformation behavior［J］．Nordic Pulp and Paper Research Journal，2004，19(1):89．

［21］ Somwang K，Enomae T，Onabe F．Effect of fiber hornification in recycling on bonding potential at interfiber crossings:Confocal laserscanning microscopy(CLSM)［J］．Japan Tappi Journal，2002，56(2):239．

［22］ Moss P A，Retulainen E．The effect of fines on fibre bonding:crosssectional dimensions of TMP fibres at potential bonding sites［J］．Journal of Pulp and Paper Science，1997，23(8):382．

［23］ ZHANG Wei-wei，XIAO Hui-ning，QIAN Li-ying．Enhanced water vapour barrier and grease resistance of paper bilayer-coated with chitosan and beeswax［J］．Carbohydrate Polymers，2014，101:401．

［24］ Ozaki Y，Bousfield D W，Shaler S M．Three-dimensional characterization of ink vehicle penetration by laser scanning confocal microscopy［J］．Journal of Pulp and Paper Science，2005，31(1):48．CPP