林 黎，崔 軍，陳學萍，方長明

(復旦大學生命科學學院生態(tài)與進化生物學系， 上海 200433)

灘涂圍墾和土地利用對土壤微生物群落的影響

林 黎，崔 軍，陳學萍，方長明*

(復旦大學生命科學學院生態(tài)與進化生物學系， 上海 200433)

土壤微生物在生態(tài)系統(tǒng)營養(yǎng)物質(zhì)循環(huán)過程，特別是碳、氮循環(huán)過程中扮演著重要的角色。上海市崇明島位于長江入?？?，因其土壤發(fā)育時間較短、土地利用歷史背景清晰、土壤本底均一，不同土壤圍墾年代的土壤，代表了土壤發(fā)育年代的不同時期。以空間變化代替時間變化，對崇明島稻田和旱地6個不同圍墾年代土壤的磷酸脂肪酸(PLFA)指紋圖譜研究表明，濕地灘涂圍墾16a后土壤微生物總PLFA、細菌PLFA、革蘭氏陽性菌(G+) PLFA和革蘭氏陰性菌(G-) PLFA含量顯著降低。隨著圍墾時間的逐步增加，PLFA含量逐步上升。經(jīng)過長時間的農(nóng)業(yè)種植，G+PLFA在圍墾120a和300a稻田和旱地土壤中沒有顯著性差異；而總PLFA、細菌和G-PLFA在圍墾75、120a和300a的土壤中含量趨于穩(wěn)定且沒有顯著性差異。圍墾16a和40a稻田土壤中總PLFA和G+PLFA顯著高于旱地土壤；圍墾40a稻田土壤中細菌和G-PLFA顯著高于旱地土壤。不同圍墾年代土壤總PLFA、細菌PLFA與土壤總氮、粘土含量成顯著的正相關關系。河口濕地圍墾后微生物數(shù)量的變化與土壤營養(yǎng)含量存在強烈相關關系，提示土壤圍墾及演替過程中微生物與土壤肥力之間的緊密關系，對探討土壤演替過程中微生物群落的變化具有重要意義。

崇明濕地；圍墾；土地利用；微生物群落；磷酸脂肪酸

微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分，在有機物分解、養(yǎng)分循環(huán)、氮的固定、土壤結構等方面有著舉足輕重的作用。同時，土壤中微生物受到耕作方式、土壤質(zhì)地、土壤層次、植被和土壤自然環(huán)境等因素的影響，土壤微生物群落結構及其多樣性又在一定程度上反映了土壤生態(tài)系統(tǒng)的結構、功能及過程。

崇明島位于長江入?？?，占地面積1267 km2，屬于亞熱帶季風氣候區(qū)，四季分明，年平均氣溫約為16 ℃，年平均降水量為1144 mm。崇明島東灘是中國長江口規(guī)模最大、發(fā)育最完善的河口型灘涂濕地，長江入海徑流攜帶的泥沙在河口附近沉積，塑造了廣闊的潮灘濕地，而崇明島東灘則以每年100多米的推進速度向東海推進，使東灘灘涂面積不斷於漲[1]。圍墾區(qū)的土壤來自于灘涂淤積的泥沙，因土壤發(fā)育時間相對較短，其土壤本底較為均一。不同土壤圍墾年代的土壤，代表了土壤發(fā)育的不同時期，在自然條件下，土壤發(fā)育的空間變化可以代替時間尺度上的變化[2]。崇明島長江河口濕地灘涂圍墾后自然條件的相對穩(wěn)定、土壤本底條件的相對一致性、以及相對單一和清晰的土地利用背景為人們提供了一個研究人類長期的干擾活動對土壤微生物群落影響的機會。

崇明島灘涂圍墾后的土壤具備相當完善的年代發(fā)育序列，以空間代替時間，進行土壤微生物群落研究，對討論自然環(huán)境狀態(tài)下土壤發(fā)育過程有重要意義，對土壤微生物群的討論有助于闡明土壤生態(tài)系統(tǒng)動態(tài)過程，對于合理開展灘涂圍墾有理論指導意義。

1 材料與方法

1.1 取樣

研究地點位于上海市崇明島(東經(jīng)121°09′—121°54′，北緯31°27′—31°51′)。崇明島灘涂圍墾后土壤空間尺度上的變化，代表了土壤發(fā)育年代的變化；根據(jù)崇明島灘涂土壤圍墾的時間、土地利用歷史記載及當?shù)爻Ｗ【用裉峁┑男畔?，本研究共選取了6個不同年代的土壤[2- 4]。實驗涉及2種不同的土地利用方式：稻田和旱地，以未圍墾的東灘濕地灘涂土壤為0年代土壤，涉及了5個灘涂圍墾后不同年代序列的土壤，包括16，40，75，120，300a。

灘涂圍墾后16a和40a的實驗樣點根據(jù)Gao等的文獻報告選取[3]； 300a的實驗樣點根據(jù)崇明島當?shù)毓俜轿墨I記錄選取[4]；75a和120a的實驗樣點根據(jù)當?shù)?位以上常住居民提供的信息選取，因此75a和120a的土壤可能有10—20a的誤差[2]。

為了使實驗結果能更準確反映不同的土地發(fā)育年限對土壤微生物群落的影響，實驗選擇耕作方式相對穩(wěn)定的實驗樣點，每一個樣點設有3個平行樣地，每個平行樣地間隔距離在500—1000 m；為了盡量減少環(huán)境因素造成的實驗誤差，在每塊樣地中以S形設置6個采樣點，各采樣點間距約為5—8 m，用土鉆鉆取表層0—20 cm鮮土，并將該6個采樣點采取的土壤均勻混合為1個混合樣本，于保溫盒加冰袋保存運回實驗室冷凍保存?zhèn)溆?。Cui 等對不同年代土壤的理化性質(zhì)進行了詳細測量，本實驗研究涉及土壤樣品的部分理化性質(zhì)如表1所示[2]。

表1 不同圍墾年代土壤的部分理化性質(zhì)[2]

1.2 磷酸脂肪酸(PLFA)的提取和檢測方法

1.2.1 PLFA的提取和檢測

PLFA的提取方法改良自Zelles的傳統(tǒng)提取方法[5- 6]，PLFA的提取流程如下：稱取4 g凍干土于25 mL比色管中，加3 mL 檸檬酸緩沖液和12 mL甲醇∶氯仿(2∶1)混合液，充分震蕩萃取2次；加4 mL氯仿和4 mL檸檬酸緩沖液混合液，放置過夜分層后，取下層溶液，用氯仿萃取3次；旋轉蒸發(fā)萃取液至少量后，將萃取液過層析柱層析；將層析柱淋出液于三角瓶中40 ℃蒸干，并加0.5 mL 二氯甲烷和1 mL甲醇鈉溶液，在50 ℃下加熱10 min甲酯化磷脂；加6 mL分析純正己烷振蕩萃取，上清液經(jīng)無水硫酸鈉過濾后，在10 mL KD濃縮器中經(jīng)氮氣吹干，最后用色譜純正己烷定容至100 μL，即可上機檢測。

檸檬酸緩沖液的配比為9.38 g檸檬酸和11.03 g檸檬酸鈉溶于250 mL重蒸水。甲醇鈉溶液配比為1 g NaOH溶于50 mL分析純甲醇。甲酯化磷脂(FAME)標準品購自英國Supelco公司(Supelco, Supelco UK, Poole, Dorset, UK)，包括共25種FAMEs。

實驗中使用的儀器包括：數(shù)控恒溫水浴儀(北京帥恩科技有限責任公司，型號SE812J)，氮吹儀，旋轉蒸發(fā)儀(上海申生科技有限公司，R系列)，循環(huán)水式樣真空泵，Agilent 6820氣象色譜儀。色譜分析采用FID檢測器檢測，檢測器溫度280 ℃，進樣口溫度250 ℃，柱箱初始溫度120 ℃，最高溫度300 ℃，吹掃氣體N2，吹掃時間0.75 min，色譜柱采用長30.0 m、直徑為320.00 μm的HP- 5MS毛細管柱，數(shù)據(jù)采集頻率為20 Hz。

1.2.2 PLFA作為生物標記

本研究用到的PLFA生物標記分組如表2所示。生物標記物可分為通用生物標記物和特定生物標記物兩類。通用生物標記物可反映總生物量，如PLFA、酯鏈磷脂脂肪酸(EL-PLFA)的總量可用于了解土壤微生物總生物量[7- 8]；單不飽和脂肪酸(MUFA)可用作革蘭氏陰性細菌的通用生物標記[9]；雙不飽和脂肪酸18:2ω6,9可用作真菌的特定生物標記[6]。

本研究PLFA命名規(guī)則采取通用的ω系統(tǒng)。前綴a，i，和cy分別表示反式，順式和環(huán)狀支鏈構型。以18:2ω6,9為例，18表示主鏈C原子數(shù)目，冒號“:”后緊跟的數(shù)字代表不飽和度，ω后的數(shù)字代表雙鍵所在的位置。

表2 PLFA分析生物標記分組

前綴a，i，和cy分別表示反式，順式和環(huán)狀支鏈構型

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗采用Microsoft Excel 2007進行一般數(shù)據(jù)處理，采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。不同圍墾年代土壤PLFA方差分析Post hoc采用Duncan′s test方法，PLFA與土壤基本性質(zhì)相關性分析采用Spearman方法。

2 結果

2.1 PLFA作為生物標記

PLFA總量反應了土壤微生物總生物量[7]。如圖1中A所示為旱地和稻田不同圍墾年代土壤總PLFA的對照圖。圍墾16a土壤的總PLFA相對于未圍墾的濕地灘涂土壤顯著降低(P<0.05)。隨著圍墾時間的逐步增加，稻田和旱地土壤總PLFA含量逐步上升。圍墾75、120a和300a的土壤總PLFA逐漸趨于穩(wěn)定且沒有顯著差異(P>0.05)。

類似的變化趨勢在細菌、革蘭氏陽性(G+)和革蘭氏陰性菌(G-)PLFA中也有發(fā)現(xiàn)。如圖1所示，圍墾16a的土壤中細菌、G+和G-PLFA相對于濕地灘涂土壤均顯著性降低(P<0.05)。隨著圍墾后時間的逐步增加，PLFA含量逐步上升。G+PLFA在圍墾120a和300a土壤中沒有顯著性差異(P>0.05)；而細菌和G-PLFA在圍墾75、120a和300a土壤中沒有顯著性差異(P>0.05)。

圖1 稻田和旱地不同圍墾年代土壤的總PLFA，細菌，真菌，革蘭氏陽性菌，革蘭氏陰性菌和Cy/Pre比值Fig.1 Total PLFA, bacteria, Fungi, G+, G-, and Cy/Pre ratio of paddy and upland soils corresponding to soil ages每個土壤圍墾年代相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)

在兩種土地利用方式下，如圖1，圍墾16a和40a稻田土壤微生物總量、G+PLFA顯著高于旱地土壤(P<0.05)；如圖1所示，圍墾40a稻田土壤中細菌PLFA和G-PLFA顯著高于旱地土壤(P<0.05)。而圍墾75、120a和300a稻田土壤微生物PLFA與旱地土壤無明顯差異(P>0.05)。

土壤微生物環(huán)狀支鏈的磷脂酸(Cy)及其前體(Pre，一般是單不飽和磷脂酸)之間的比值Cy/Pre往往隨著環(huán)境脅迫作用的影響而發(fā)生改變[6，9- 10]。如圖1所示，隨著圍墾后時間的逐步增加，稻田和旱地土壤Cy/Pre比值均逐步升高，并在圍墾40年代的土壤中達到最大值；圍墾40a和75a土壤Cy/Pre比值均顯著高于濕地灘涂土壤(P<0.05)。圍墾120a和300a土壤Cy/Pre比值沒有顯著性差異(P>0.05)，但總是顯著高于濕地灘涂土壤(P<0.05)。

2.2 PLFA指紋圖譜主成份分析

對PLFA指紋圖譜做主成份分析的前提是各磷酸酯之間不相關。相關性檢驗表明磷脂酸12：0和13：0具有顯著的相關關系(P<0.05)。因此排除了磷脂酸12：0后，對不同年代土壤的磷酸酯做主成份分析(PCA)，結果如圖2所示。

圖2 PCA分析主成份PC1和PC2散點圖Fig.2 PC1 and PC2 scatter diagram of PCA analysis

PCA分析得到兩個主要成份因子PC1和PC2，分別解釋了不同年代土壤PLFA指紋圖譜差異的51.12%和18.57%。從圖2中可以進一步看出，圍墾75a后的土壤(包括75a)與75a前的土壤清晰地區(qū)別開來。圍墾75a后土壤微生物生物量的恢復和Cy/Pre比值的降低，以及圍墾后120a和300a土壤微生物生物量和Cy/Pre比值的相對穩(wěn)定，提示土壤微生物可能需要相當長的時間適應和克服環(huán)境壓力。PCA分析中，圍墾75a后的土壤(包括75a)與之前的土壤明顯區(qū)別開來，也從另一方面證明了這一假設。

2.3 PLFA與土壤基本性質(zhì)相關性

Cui等對不同圍墾年代土壤理化性質(zhì)進行了全面的分析[2]。將部分土壤基本性質(zhì)與各群落PLFA進行了相關性分析，結果如表3所示。不同圍墾年代土壤總PLFA、細菌PLFA與總氮成極顯著的正相關關系(P<0.01)；同時總PLFA、細菌PLFA與粘土含量成顯著的正相關關系(P<0.05)。另外，Cy/Pre比值與總氮含量顯著相關(P<0.05)，真菌PLFA與含水量顯著相關(P<0.05)。

3 討論

3.1 河口濕地灘涂圍墾對土壤微生物各群落PLFA含量的影響

濕地灘涂土壤圍墾后，顯著降低了土壤微生物總PLFA、細菌PLFA、G+PLFA和G-PLFA含量(P<0.05)，同時顯著提高了土壤Cy/Pre比值(P<0.05)。Schutz等利用PLFA的方法，對人工地下水再生系統(tǒng)中水淹部分和未被水淹部分的森林土壤進行了微生物群落的研究，發(fā)現(xiàn)水分脅迫會誘導Cy/Pre比值的增加[14]。Cordova-Kreylos等對加里福利亞濱海鹽堿濕地進行了土壤微生物群落結構的研究，發(fā)現(xiàn)重金屬污染物和有機污染與環(huán)狀磷脂酸成顯著的正相關關系[15]。Dickens等采用氯仿熏蒸的方法，對沼澤和森林兩種土壤進行了微生物群落結構的PLFA分析，發(fā)現(xiàn)熏蒸培養(yǎng)后的土壤，誘發(fā)生產(chǎn)了大量的環(huán)狀磷脂酸Cyclic 19:0，而Cyclic 19:0是Cy/Pre比值分子的重要組成部分之一[16]。本研究中，圍墾后稻田和旱地土壤微生物生物量均有顯著性降低，提示長江河口濕地灘涂土壤圍墾后，土地利用對土壤微生物產(chǎn)生了長期的脅迫壓力。

表3 PLFA與土壤基本性質(zhì)相關性分析

** 表示P<0.01水平顯著相關；* 表示P<0.05水平顯著相關

圍墾16a和圍墾40a土壤微生物總PLFA、細菌PLFA、G+PLFA和G-PLFA逐步增加，而總PLFA、細菌和G-PLFA在圍墾75、120a和300a土壤中含量趨于穩(wěn)定且沒有顯著性差異(P>0.05)。Cui等對崇明島東灘不同圍墾年代土壤的理化性質(zhì)進行了詳細的分析，發(fā)現(xiàn)圍墾16a土壤有機碳相對于濕地灘涂土壤迅速降低，但是在圍墾40a后土壤有機碳、氮、磷等營養(yǎng)元素逐漸積累并得到恢復[2]。經(jīng)過長時間的農(nóng)業(yè)種植，土壤營養(yǎng)環(huán)境逐漸改善，可能是圍墾75、120a和300a土壤微生物群落PLFA含量差異減少并趨于穩(wěn)定的主要原因。

不同圍墾年代土壤真菌PLFA含量沒有明顯的變化趨勢。Kasel等曾經(jīng)對澳大利亞不同地區(qū)4種不同的土地利用方式進行了真菌群落結構的研究，發(fā)現(xiàn)真菌群落結構具有很高的可變性[17]。土壤中的真菌相對于細菌，其菌絲更容易受到環(huán)境干擾因素的影響，使其在不同土地利用方式和土壤圍墾年代下含量的變化波動較大。

3.2 土地利用對土壤微生物各類群PLFA含量的影響

圍墾16a和40a稻田土壤微生物總PLFA、G+PLFA顯著高于旱地土壤(P<0.05)，圍墾40a稻田土壤細菌PLFA和G-PLFA顯著高于旱地土壤(P<0.05)。而圍墾75、120a和300a稻田土壤微生物總PLFA與旱地土壤無顯著性差異(P>0.05)。Drenovsky等對美國跨洲際的8種不同土地利用方式土壤進行了研究，得出土地利用方式是驅動微生物群落結構變異主要因子的結論[18]。Bossio等采用了DGGE的實驗方法，對肯尼亞熱帶林地和農(nóng)業(yè)土壤微生物群落結構進行了探討，結果也表明不同的土地利用方式是影響土壤微生物群落結構最重要的影響因素[19]。不同的土地利用方式，可能通過改變土壤鹽堿度、pH值、含水量、有機物含量等，影響土壤微生物群落結構。稻田和旱地不同的灌溉方式及土壤營養(yǎng)元素的投入，可能導致土壤營養(yǎng)物質(zhì)、pH值及鹽堿度等存在差異，從而造成微生物含量的差異。

3.3 土壤微生物群落PLFA含量與土壤基本性質(zhì)的相關性

4 結論

河口濕地灘涂圍墾和土地利用，增大了土壤微生物的生存壓力，顯著降低了土壤微生物總PLFA、細菌PLFA、G+PLFA和G-PLFA含量。隨著圍墾時間的逐步增加，PLFA含量逐步上升。經(jīng)過長時間的農(nóng)業(yè)種植，土壤營養(yǎng)環(huán)境逐漸改善，G+PLFA在圍墾120a和300a稻田和旱地土壤中沒有顯著性差異；而總PLFA、細菌和G-PLFA在圍墾75、120a和300a土壤中含量趨于穩(wěn)定且沒有顯著性差異。圍墾16a和40a稻田土壤微生物總PLFA、G+PLFA顯著高于旱地土壤；圍墾40a稻田土壤中細菌PLFA和G-PLFA顯著高于旱地土壤。不同圍墾年代土壤總PLFA、細菌PLFA與土壤總氮、土壤粘土含量成顯著的正相關關系，總N或總有機C等營養(yǎng)元素的投入和土壤結構的變化可能是造成微生物群落結構產(chǎn)生變化的原因之一。真菌因其更易受到輕微改變的環(huán)境因子的影響，使其在不同土地利用方式和土壤圍墾年代下含量的變化波動較大。河口濕地圍墾后微生物數(shù)量的變化與土壤營養(yǎng)含量存在強烈相關，提示土壤圍墾及演替過程中微生物與土壤肥力之間的緊密關系，對探討土壤演替過程中微生物群落的變化具有重要意義。

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Effects of reclamation on tidal flat and land use on soil microbial community

LIN Li, CUI Jun, CHEN Xueping, FANG Changming*

CoastalEcosystemsResearchStationofYangtzeRiverEstuary,MinistryofEducationKeyLaboratoryforBiodiversityandEcologicalEngineering,TheInstituteofBiodiversityScience,FudanUniversity,Shanghai200433,China

Soil microbes play a vital role in nutrient cycling, especially in carbon and nitrogen cycling. Microbes are influenced and regulated by many factors, such as anthropogenic disturbances, environmental conditions and soil properties. Little has been reported on soil microbial response to long term cultivation after reclamation of estuary wetland. One of possible reasons may be the heterogeneity of soil background and complicated land use history. The Chongming Island, located in the estuary of Yangtze River, was originated mainly from periodical reclamation on tidal flat. Because of an excellent homogeneous soil background and a relatively short and clear land use history on the island, the chronosequence of soils reflects mainly microbial response to soil development and cultivation. Phospholipid Fatty Acids (PLFA) are principle components of microbial cell membranes. Its pattern can be used as a fingerprint of soil microbes to provide insight information of soil bacterial and fungal communities because different microbes show different PLFA profile patterns.

This research focused on a chronosequence of 6 soil ages under two different cultivation (paddy rice and upland cropping) systems, including 0 (unclaimed wetland soil), 16, 40, 75, 120 and 300 years old soils. PLFA analysis results showed that after reclamation of coastal wetland, soil total PLFA, bacterial PLFA, Gram-positive (G+) PLFA and Gram-negative (G-) PLFA all reduced significantly in both paddy rice and upland cropping soils. Microbial PLFA abundance then increased gradually over several decades in both paddy rice and upland cropping soils. After a long-term human cultivation, no significant difference in G+PLFA was observed in 120 or 300 years old soils, either in paddy rice or upland cropping soils. No significant difference in total PLFA, bacterial PLFA or G-PLFA was observed among 75, 120 or 300 years old soils. Principle component analysis (PCA) showed that two principle components, PC1 and PC2, could explain 51.12% and 18.57% of the total PLFA variation, respectively. PCA also revealed that PLFA profiles of 75, 120 and 300 years old soil were clearly different from those of 0, 16 and 40 years old soil. Cultivations of paddy rice and upland crops have significantly affected soil microbial structure. Total PLFA and G+PLFA were significantly higher in 16 and 40 years old paddy soils than those of upland cropping soils. Bacterial and G-PLFA were significantly higher in 40 years old paddy rice soils than those of upland cropping soils. Soil total PLFA and bacterial PLFA were significantly correlated to soil total nitrogen and clay content, suggesting strong relations between soil microbes and soil nutrient status. The PLFA results indicated that human cultivations have led to environmental stress on soil microbes and this stress was gradually relieved along with long-term cultivations, because of improved soil nutrient conditions due to inputs of carbon, nitrogen and phosphorus fertilizers.

This study provided deep insights into soil microbial structures of different soil ages based on PLFA analysis under paddy and upland cultivation systems, which are two major cropping systems in China. It was helpful for us to better understand the development of soil microbial communities along with soil succession in arable soils.

Chongming Island; reclamation; land use; soil microbial structure; Phospholipid Fatty Acid

科技部氣候變化專項資助項目(2010CB950600)；上海市科委資助項目(09DZ1900106)

2013- 05- 27;

2013- 10- 16

10.5846/stxb201305271198

*通訊作者Corresponding author.E-mail: cmfang@fudan.edu.cn

林黎，崔軍，陳學萍，方長明.灘涂圍墾和土地利用對土壤微生物群落的影響.生態(tài)學報,2014,34(4):899- 906.

Lin L, Cui J, Chen X P, Fang C M.Effects of reclamation on tidal flat and land use on soil microbial community.Acta Ecologica Sinica,2014,34(4):899- 906.