李安政+林芳燦+

摘要：在利用原生質(zhì)體單核化對5個供試香菇（Lentinula edodes）菌株進行常規(guī)交配型分析的基礎(chǔ)上，采用培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換法對各菌株孢子單核體的交配型組合進行了鑒定。結(jié)果表明，應(yīng)用培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換法可以觀察到3種形態(tài)明顯不同的菌落，即由A≠B≠配對形成的具鎖狀聯(lián)合的絨毛狀菌落、由A≠B=配對形成的無鎖狀聯(lián)合的柵欄型菌落及由A=B≠配對形成的無鎖狀聯(lián)合的絨毛狀菌落。由于該方法可清楚區(qū)分通常無明確形態(tài)差異的A=B≠和A≠B=反應(yīng)，因此，用于香菇孢子單核體交配型因子的準確鑒定是行之有效的。

關(guān)鍵詞：香菇（Lentinula edodes）；四極性；交配型分析；標準測交菌株

中圖分類號：S646．1+２文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０14）08－1835-04

Accurate Identification of Mating Types in Lentinula edodes Using Switching Culture Medium

LI An-zheng1，LIN Fang-can2

（1. Teaching and Research Section of Biotechnology，Hubei University of Chinese Medicine，Wuhan 430065，China；

2. Institute of Applied Mycology，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China）

Abstract： Based on analyzing the regular mating types of five Lentinula edodes strains， switching culture medium was used for identifying of mating type factors of monkaryons derived from each of these strains. The results showed that three kinds of typical colony could be observed. Fluffy colony with clamp connection formed by A≠B≠ pairs， barrage colony without clamp connection formed by A≠B=pairs， and fluffy colony without clamp connection formed by A=B≠ pairs. Switching culture medium can definitely discriminate mating reactions between A=B≠ and A≠B=， and is effective to identify mating type factors of L. edodes exactly.

Key words： Lentinula edodes； tetrapolar； mating type analysis； standard tester strain

香菇（Lentinula edodes）是一種食藥用真菌，也是世界三大栽培蕈菌之一［1］。作為一種異宗結(jié)合的四極性擔子菌，香菇的交配系統(tǒng)由兩個非連鎖的A、B交配型因子所控制，它們的子實體產(chǎn)生4種交配型 （AxBx、AyBy、AyBx、AxBy）的有性孢子；只有兩對因子均不相同的組合即AxBx＋AyBy或AyBx＋AxBy，才能正常結(jié)實并完成整個有性生活史［2，3］。

在食用蕈菌交配型分析的常規(guī)程序中，要點是要從供試單孢中找到代表4種交配型的標準測交菌株（T1、T2、T3和T4）［4］，因而通常需要隨機挑選一定數(shù)量的單孢（如20個以上）進行兩兩配對［5］，工作量較大。原生質(zhì)體單核化技術(shù)［6］的出現(xiàn)為交配型的鑒定提供了更可靠而簡便的方法，因為標準測交菌株T1、T2可以直接利用該技術(shù)從供試單孢的親本雙核體獲得。

通過交配型分析的常規(guī)程序可以明確T1和T2、T3和T4間均是A≠B≠；而對T1與T3、T1和T4、T2與T3、T2和T4間的關(guān)系，只可能知道有一個交配型因子相同，具體是哪個交配型因子相同卻難以區(qū)分。為進行交配型因子的深入研究，或在分子生物學研究中要建立不同交配型的基因池時，需要對4種類型的擔孢子的交配型進行準確鑒定。

在四極性異宗結(jié)合的模式蕈菌裂褶菌（Schizophullum commune）中，4種不同的交配反應(yīng)（A≠B≠、A=B≠、A≠B=及A=B=）能分別形成具鎖狀聯(lián)合的菌落（“+”反應(yīng)）、無鎖狀聯(lián)合的平貼型菌落（“F”反應(yīng)）、無鎖狀聯(lián)合的柵欄型菌落（“B”反應(yīng)）及形態(tài)無明顯變化的單核菌落（“－”反應(yīng)）。因此通過交配反應(yīng)的菌落特征，能準確識別參試單核體的交配型［7］。在同為四極性異宗結(jié)合種的香菇中，具鎖狀聯(lián)合的可親和反應(yīng)（A≠B≠）易于與3種不親和反應(yīng)相區(qū)別，但3種不親和反應(yīng)（A=B=、A=B≠和A≠B=）因無明顯形態(tài)差異彼此無法明確區(qū)分，從而給產(chǎn)生不親和反應(yīng)的兩個供試單核體的交配型因子的準確鑒定造成困難。Darmono等［8］開發(fā)了培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換法首次應(yīng)用于蜜環(huán)菌（Armillaria mellea）的交配反應(yīng)的鑒定中，為香菇交配型的準確鑒定提供了一種新思路。

研究將在利用原生質(zhì)體單核化方法對香菇進行交配型常規(guī)分析的基礎(chǔ)上，試用培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換法對4種單孢的交配型進行準確鑒定，為深入研究香菇的交配型因子的結(jié)構(gòu)等方面打下基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

供試香菇栽培菌株IB02、IB08由河南省科學院生物研究所提供，HL01由華中農(nóng)業(yè)大學菌種廠提供，野生菌株GAN057、SHX002采集自野外環(huán)境。木屑代料培養(yǎng)基、PDA（馬鈴薯、葡萄糖）培養(yǎng)基、CYM（磷酸鹽、硫酸鎂、葡萄糖、酵母膏和蛋白胨） 培養(yǎng)基、MYG（麥芽糖、酵母膏、葡萄糖） 培養(yǎng)基、OWE（橡樹木屑浸汁） 培養(yǎng)基、SOJ（鮮榨橘汁）培養(yǎng)基和木屑培養(yǎng)基［8，9］的配制參照文獻［8］、［9］所述的方法進行。

1.2方法

1.2.1雙核菌株的栽培、擔孢子的收集及孢子單核體的制備6月中旬，在玻璃瓶中裝入木屑代料培養(yǎng)基，高壓滅菌2 h，冷卻后接種，參照文獻［10］所述的方法栽培后收獲子實體，進行孢子的收集和孢子單核體的制備。

1.2.2標準測交菌株T1、T2、T3和T4的確定用原生質(zhì)體單核化方法對雙核菌絲體進行原生質(zhì)體的制備［4］，將所得的原生質(zhì)體再生菌株兩兩配對，以鎖狀聯(lián)合的有無作為親和與否的標準，選出一對可親和的單核化菌株，分別命名為T1、T2，即為所需的標準測交菌株T1、T2。將上述標準測交菌株T1、T2與相應(yīng)的孢子單核體進行配對，從與T1、T2都不親和的配對中選出部分孢子單核體進行兩兩配對，再從這些配對中選出一對可親和的孢子單核體，分別命名為T3、T4，即為所需的標準測交菌株T3、T4。

1.2.3單核體交配型的鑒定用4個標準測交菌株T1、T2、T3和T4與所有的孢子單核體進行配對，鏡檢配對菌絲鎖狀聯(lián)合的有無，根據(jù)反應(yīng)情況確定孢子單核體的交配型。

1.2.4鑒定交配型的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換法兩個單核體間的交配反應(yīng)通過鎖狀聯(lián)合的有無加以鑒定。凡有鎖狀聯(lián)合的配對為A、B因子均不相同（A≠B≠）的親和反應(yīng)。A因子或B因子相同（A=B≠、A≠B=）的不親和反應(yīng)通過培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換法加以鑒定［8］：將兩個供試單核體在OWE培養(yǎng)基上以25 ℃對峙培養(yǎng)10～14 d后，沿與反應(yīng)區(qū)相垂直的方向穿過兩菌落切取4 mm×30 mm的菌塊，轉(zhuǎn)移至SOJ培養(yǎng)基上，于25 ℃繼續(xù)培養(yǎng)10～14 d。凡出現(xiàn)無鎖狀聯(lián)合的絨毛狀菌落為A=B≠的反應(yīng)；凡出現(xiàn)無鎖狀聯(lián)合的柵欄型菌落為A≠B=的反應(yīng)。

2結(jié)果與分析

2.1原生質(zhì)體單核體的鑒定及標準測交菌株T1、T2的確定

對5個供試雙核菌株，先對相應(yīng)的子實體進行組織分離培養(yǎng)以得到菌絲，再對菌絲進行原生質(zhì)體單核化。酶解涂平板后置于25 ℃培養(yǎng)，5 d左右即出現(xiàn)肉眼可見的白色再生菌落。挑取其中直徑較小的菌落（生長相對慢，是單核的可能性較大）至PDA試管斜面培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，每天挑取一次，連續(xù)挑取（約7 d左右）至平板長滿菌絲不能再挑取為止。

對初步挑取到試管斜面的再生菌落菌絲進行鏡檢，無鎖狀聯(lián)合的確定為單核體，最終每個雙核菌株獲得的原生質(zhì)體再生單核體數(shù)量在54~80之間。交配型鑒定結(jié)果表明，屬于每種雙核菌株的原生質(zhì)體再生單核體均可獲得兩種交配型（表1）。將兩種交配型的單核體中一種命名為T1，另一種命名為T2；指定T1的交配型為AxBx，則T2的交配型可定為AyBy。T1、T2即為所需的標準測交菌株。

2.2標準測交菌株T3、T4的確定及孢子單核體交配型的常規(guī)分析

每個雙核菌株分離到的后代單孢數(shù)量均達到50個以上。通過與標準測交菌株T1、T2的配對，從與T1、T2均不親和的單孢中選出了一對不親和的組合，即為所需的標準測交菌株T3和T4。

將每個雙核菌株后代單孢與相應(yīng)的4個標準測交菌株進行交配鑒定，將配對反應(yīng)中僅分別與T2、T1、T4和T3親和的單孢分別歸為T1組、T2組、T3組和T4組，從而將相應(yīng)的單孢分為4種類型。其中T1組、T2組的交配型分別為AxBx、AyBy；指定T3組的交配型為AxBy，則T4組的交配型為AyBx。

2.34類孢子單核體菌株交配型的準確鑒定

2.3.1培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換法與交配型的準確鑒定對每一種雙核菌株的4組后代單孢，每組隨機取3株，應(yīng)用培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換法進行所有可能的6種組合（T1×T2、T3×T4、T1×T3、T2×T4、T2×T3、T1×T4）的配對，觀察分析6×9＝54個配對在SOJ培養(yǎng)基上的反應(yīng)情況，結(jié)果出現(xiàn)3種特征明顯的反應(yīng)。

表2列出了香菇雙核菌株HL01的單核體在SOJ培養(yǎng)基上的配對反應(yīng)結(jié)果，圖1為香菇HL01出現(xiàn)3種特征明顯反應(yīng)的菌落的生長狀況。從表2、圖1可以看出，“+”反應(yīng)表示具有鎖狀聯(lián)合的絨毛狀菌落，菌絲生長較快，出現(xiàn)這種反應(yīng)的兩個配對單核體交配型應(yīng)該是A、B因子均不相同（A≠B≠）；“F”反應(yīng)表示不具鎖狀聯(lián)合的絨毛狀菌落，菌絲生長相對較慢，出現(xiàn)這種反應(yīng)的兩個配對單核體交配型應(yīng)該是A因子相同、B因子不同（A=B≠）；“B”反應(yīng)表示無鎖狀聯(lián)合的柵欄型菌落，兩個配對單核體之間形成一條明顯的排斥帶，出現(xiàn)這種反應(yīng)的兩個配對單核體交配型應(yīng)該是A因子不同、B因子相同（A≠B=）。

從表2可以看出，在6種配對組合中，T1×T2和T3×T4的菌絲反應(yīng)均是一致的“+”反應(yīng)，可以肯定它們交配型的關(guān)系是A≠B≠，即T1組與T2組是A≠B≠，T3組與T4組也是A≠B≠。這種結(jié)果實際上通過前面所述常規(guī)的交配型鑒定方法已經(jīng)確定，在此用培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換法只是進一步驗證一下而已。

T1×T3與T2×T4中均是“B”反應(yīng)占大多數(shù)（8個“B”反應(yīng)，1個不典型的“B”反應(yīng)即“B-”反應(yīng)）；T2×T3也是一致的“F”反應(yīng)，T1×T4則是“F”反應(yīng)稍占優(yōu)勢（5個“F”反應(yīng)，4個不典型的“F”反應(yīng)即“F-”反應(yīng)）。從這些反應(yīng)結(jié)果可以看出一種趨勢，即T1×T3、T2×T4應(yīng)該是“B”反應(yīng)；T2×T3和T1×T4應(yīng)該是“F”反應(yīng)。

實際上，4對配對組合（T1×T3、T2×T4、T2×T3和T1×T4）的菌絲反應(yīng)結(jié)果是可以相互印證的，例如，從T2×T3是一致的“F”反應(yīng)這種結(jié)果可以推斷，T1×T4也應(yīng)當是“F”反應(yīng)，而相對應(yīng)的T1×T3與T2×T4則應(yīng)當是“B”反應(yīng)。

根據(jù)上述對表2及圖1的分析可以得出，T1×T3和T2×T4的反應(yīng)均為A≠B=，而T1×T4和T2×T3的反應(yīng)則均為A=B≠。因此，在指定T1和T2的交配型分別為A1B1和A2B2的情況下，T3的交配型為A2B1，T4的交配型為A1B2。

2.3.2交配型的鑒定結(jié)果通過核遷移試驗和培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換法最終鑒定出了各組單核體的準確的交配型（表3）。對HL01菌株，用OWE-SOJ培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換法鑒定T1、T2、T3和T4的交配型分別為A1B1、A2B2、A2B1和A1B2。

3討論

在擔子菌的交配型分析中，最可靠的方法是兩兩配對法，但在樣本容量很大時該方法的工作量也顯著增大。如本研究中HL01的189個后代單孢菌株如按此方法進行交配型的鑒定，需C1892=17 766個配對。而用標準測交菌株法，理論上只需189×4＝756個配對，極大地減少了鑒定工作量。標準菌株法的至關(guān)重要的一點是要求4個標準測交菌株絕對準確、可靠。采用原生質(zhì)體單核化的方法可以準確獲得與親本雙核體交配型相同的T1（A1B1）、T2（A2B2）兩種標準測交菌株。采用培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換法可以對4個標準測交菌株的交配型進行準確鑒定。

在香菇中，由于沒有明確的形態(tài)差異，兩種不親和反應(yīng)即A=B≠和A≠B=難以相互區(qū)別。在對四極性蕈菌進行常規(guī)交配型分析的過程中，測交菌株T3的選擇是隨機的，其交配型既有可能是AxBy，也有可能是AyBx［4］。在本研究中，將最早用于蜜環(huán)菌的交配反應(yīng)鑒定的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換法［8］應(yīng)用于香菇孢子單核體的對峙培養(yǎng)，結(jié)果A=B≠配對形成絨毛狀菌落，A≠B=配對形成柵欄型菌落，二者可以清楚地區(qū)分開來，從而有效地提高了交配型因子鑒定的準確性。

當然，在應(yīng)用培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換法進行鑒定時，每種交配型的群體需要隨機選取一定數(shù)量的單孢。因為從鑒定結(jié)果看，雖然菌落的形態(tài)只有3種類型，尤其是A=B≠配對形成絨毛狀菌落，A≠B=配對形成柵欄型菌落，但也還是有一些例外的情況出現(xiàn)，如A=B≠配對也有形成類似柵欄型菌落的，A≠B=配對的柵欄型菌落也有不典型的。這種情況下，有一定數(shù)量的單孢配對組合便可以從眾多反應(yīng)中發(fā)現(xiàn)本質(zhì)特征，從而有助于作出正確的判斷。

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