趙曉燕+楊歡+陳建剛+王昌軍+冀志霞+陳守文+

摘要：以煙草青枯病原菌［茄科雷爾氏菌（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）］為篩選指示菌，采用平板共培養(yǎng)初篩和發(fā)酵上清濾液復篩的方法，篩選到煙草青枯病拮抗菌株ＸＬＡ０３，其抑菌圈直徑為１３．７４ ｍｍ；經(jīng)１６Ｓ ｒＤＮＡ鑒定，菌株ＸＬＡ０３為解淀粉芽孢桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）。由單因素試驗和正交試驗優(yōu)化得到了菌株ＸＬＡ０３生物量較高的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基配方為玉米淀粉 １５．０ ｇ／Ｌ、豆粕５０．０ ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４·３Ｈ２Ｏ １．０ ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．７５ ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４·Ｈ２Ｏ ０．０１0 ｇ／Ｌ ；培養(yǎng)條件為起始ｐＨ ７．０，接種量１％，裝液量２０ ｍＬ／２５０ ｍＬ。

關(guān)鍵詞： 煙草青枯病菌（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）；解淀粉芽孢桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）；篩選；發(fā)酵優(yōu)化

中圖分類號：S435.72；TQ458文獻標識碼：Ａ文章編號：０４３９－８１１４（２０１４）０８－1810－０5

Screening and Fermentation Optimization of Antagonistic Bacillus against Tobacco Bacterial Wilt

ZHAO Xiao-yan1,YANG Huan2, CHEN Jian-gang1,WANG Chang-jun3, JI Zhi-xia1, CHEN Shou-wen1

(1. State Key Laboratory of Agricultural Microbiology, Huazhong Agricultural University , Wuhan 430070, China;2. Wuhan Leyang Biotechnology Co., Ltd.， Wuhan 430071, China;3. Hubei Tobacco Research Institute, Wuhan 430030, China)

Abstract: One bacterial strain was screened ｆｏｒ ｉｔｓ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｓｉｚｅ ｏｆ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉｏｓｔａｔｉｃ ｃｉｒｃｌｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｂｙ ｔｈｅ ｄｕａｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｆｉｌｔｒａｔｅ ｔｅｓｔｓ，ａｎｄ ｎａｍｅｄ ａｓ ＸＬＡ０３． Ｉｔｓ ｂａｃｔｅｒｉｏｓｔａｔｉｃ ｃｉｒｃｌｅ ｃｏｕｌｄ ｒｅａｃｈ １３ ｍｍ． Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ １６Ｓ ｒＤＮＡ， ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎ ＸＬＡ０３ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ． Ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ａｎｄ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ， ａｎ ｏｐｔｉｍａｌ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｉｔｓ ｂｉｏｍａｓｓ－ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｆｌａｓｋｓ ｗａｓ ｃｏｍｐｏｓｅｄ ｏｆ ｍａｉｚｅ ｓｔａｒｃｈ １５．０ ｇ／Ｌ， ｓｏｙｂｅａｎ ｍｅａｌ ５０．０ ｇ／Ｌ，Ｋ２ＨＰＯ４·３Ｈ２Ｏ １．０ ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．７５ ｇ／Ｌ，ＭｎＳＯ４·Ｈ２Ｏ ０．０１ ｇ／Ｌ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｗａｓ ｉｎｉｔｉａｌ ｐＨ ｏｆ ７．０， ｉｎｏｃｕｌｕｍ ｓｉｚｅ ｏｆ １％ ｌｏａｄｅｄ ｌｉｑｕｉｄ ｏｆ ２０ ｍＬ／２５０ ｍＬ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｔｏｂａｃｃｏ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｗｉｌｔ； Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ； ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ； ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ

煙草青枯病［病原物為茄科雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）］是一種典型的維管束病害，最顯著的發(fā)病癥狀是煙草植株出現(xiàn)枯萎現(xiàn)象，危害期大多出現(xiàn)在煙草旺長期或者旺長期以后，根、莖、葉部均會受害［1，2］。經(jīng)常發(fā)病產(chǎn)煙區(qū)的老病田或旱地煙田幾乎每年都會發(fā)生，形成絕產(chǎn)無收和全田發(fā)病的現(xiàn)象，造成大面積煙草產(chǎn)量、品質(zhì)下降，制約著煙草產(chǎn)業(yè)的發(fā)展［3］。目前防治煙草青枯病的方法主要包括化學防治、生物防治、加強栽培管理和選用優(yōu)質(zhì)的抗病品種［4-7］，但這些方法均無法杜絕該病的發(fā)生。生產(chǎn)過程中一般以種植抗性煙草品種和輪作為基礎，同時加強大田栽培管理，通過化學藥物輔助保護的綜合防治技術(shù)控制病害發(fā)生。由于消費者對煙草品質(zhì)的要求逐步提高，對煙草成熟期病害的防治不宜采用有殘留的化學藥劑，而使用拮抗細菌防治植物病害能達到無公害防治的目的［8，9］。

國內(nèi)外關(guān)于拮抗細菌防治植物青枯病的報道涉及的生防細菌主要有芽孢桿菌、假單胞菌、鏈霉菌等。其中芽孢桿菌是一類好氧和兼性厭氧微生物，所產(chǎn)芽孢抗逆能力強、繁殖速度快、營養(yǎng)要求簡單，易在植物表面定殖。由于其芽孢生命力強，有利于生防制劑的生產(chǎn)和儲存［10］。國內(nèi)學者相繼發(fā)現(xiàn)一些芽孢桿菌對煙草青枯病菌具有拮抗作用，尹華群等［11］從煙草健株中分離得到對煙草青枯菌有較強拮抗作用的枯草芽孢桿菌菌株001、短芽孢桿菌菌株009 和011；彭細橋等［12］從湖南桂陽煙草青枯病重病區(qū)采集的煙草健株上分離篩選出有強拮抗作用的枯草芽孢桿菌H-1、短芽孢桿菌H-9和H-11。關(guān)于煙草青枯病的拮抗芽孢桿菌的研究主要集中在拮抗機制、通過優(yōu)化培養(yǎng)條件提高其抑菌活性［13］方面，鮮見關(guān)于通過優(yōu)化拮抗菌株的發(fā)酵培養(yǎng)條件提高其生物量的報道。

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)應用中，芽孢菌劑具有易儲藏、復活性高的優(yōu)點。在芽孢桿菌發(fā)酵過程中，芽孢產(chǎn)生的情況受營養(yǎng)和培養(yǎng)環(huán)境影響較大，不同菌株的芽孢產(chǎn)生的條件也不同。本研究對影響生防菌XLA03生長的培養(yǎng)基的成分和培養(yǎng)條件進行了篩選和優(yōu)化，為獲得高濃度、高活性的芽孢用于制備生防菌制劑防治煙草青枯病奠定基礎。

1材料與方法

1.1 供試材料

煙草青枯病菌為溫室煙株葉片強致病力菌株；煙草及煙草根際土壤從湖北省恩施州咸豐縣、恩施市盛家壩和下云壩等種植區(qū)域隨機取點采樣獲得。NA培養(yǎng)基、NB培養(yǎng)基、蛋白培養(yǎng)基、纖維素培養(yǎng)基、幾丁質(zhì)培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基參照文獻［14］的方法配制。

1.2煙草青枯病拮抗菌的分離和篩選

煙草葉、莖、根經(jīng)常規(guī)表面消毒后，選擇表面無病的樣品在研缽中研磨，將組織液涂布于NA平板上。同時將少量煙株根際土壤加入有玻璃珠的無菌生理鹽水中，振蕩搖勻后稀釋涂布于NA平板上進行分離純化，將分離純化獲得的菌株進行編號。

采用平板共培養(yǎng)篩選［15］和發(fā)酵液上清濾液復篩。用煙草青枯病菌作指示菌初步測定拮抗能力，28～30 ℃正置培養(yǎng)2～3 d后觀察抑菌圈，根據(jù)抑菌圈的有無和大小判斷拮抗能力強弱。復篩時含菌培養(yǎng)基平板吹干后用打孔器打孔，試驗菌菌液通過無機濾膜過濾，取50 μL濾液注入孔中，28～30 ℃正置培養(yǎng)2～3 d后觀察抑菌圈。

1.3菌株的形態(tài)觀察及部分生理生化指標測定

以實驗室保存的解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）P1（11079）菌株為參照，菌株XLA03的生理生化鑒定參照《伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊》和《伯杰細菌鑒定手冊》。

1.416S rDNA序列相似性分析

提取試驗菌株XLA03的16S rDNA進行基因擴增［16］。純化后的產(chǎn)物測序由北京奧科生物技術(shù)有限責任公司利用ABI3730XL自動測序儀完成。菌株XLA03的16S rDNA基因測序結(jié)果用NCBI的Blast軟件進行序列相似性分析。從GenBank數(shù)據(jù)庫和核糖體數(shù)據(jù)庫中選取相近種屬的代表性菌株的16S rDNA基因序列，通過Clustal 1.8 和MEGA 4.0軟件進行系統(tǒng)發(fā)育分析，構(gòu)建基于16S rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5培養(yǎng)基成分的優(yōu)化

1.5.1單因素優(yōu)化 分別將出發(fā)培養(yǎng)基（NB培養(yǎng)基）中的碳源（葡萄糖）依次替換為玉米淀粉、蔗糖、 乳糖、麥芽糖； 氮源（牛肉膏）依次替換為玉米漿、大豆餅粉、豆粕、酵母粉； 無機鹽（氯化鈉）依次替換為硫酸鎂、磷酸氫二鉀、硫酸錳。通過拮抗菌的生物量來確定最佳碳源、 氮源和無機鹽。

確定最佳碳源、 氮源和無機鹽后，根據(jù)拮抗菌的生物量進一步優(yōu)化培養(yǎng)基，最終確定最佳碳源、氮源和無機鹽的濃度范圍。

1.5.2正交優(yōu)化試驗培養(yǎng)基成分的正交優(yōu)化試驗是根據(jù)單因素的優(yōu)化結(jié)果，選擇玉米淀粉、豆粕、 磷酸氫二鉀、硫酸錳作為培養(yǎng)基的碳源、氮源和無機鹽，每個因素選3個最佳的用量水平，采用正交表進行正交試驗，根據(jù)生物量的情況確定最佳的培養(yǎng)基配方。

培養(yǎng)條件的正交優(yōu)化試驗的因素設計以前期研究為依據(jù)。選擇起始pH、裝液量、接種量為因素，每個因素選3個不同水平，進行正交試驗，根據(jù)生物量的大小確定優(yōu)化的培養(yǎng)條件。

2結(jié)果與分析

2.1煙草青枯病拮抗菌的分離和篩選

從恩施4個煙草種植區(qū)域共采集樣品48份，分離得到192株細菌，初篩得到拮抗菌24株，復篩發(fā)現(xiàn)其中4株拮抗作用明顯，抑菌圈達到10 mm以上，具體情況見表1。其中下云壩健康煙草葉片中分離的菌株XAL03的抑菌圈最大，直徑達到13.74 mm，確定菌株XAL03對青枯病菌拮抗作用最強，將其作為試驗菌進行后續(xù)試驗。

2.2拮抗菌株XAL03的生理生化檢測

拮抗菌XAL03在LB平板上培養(yǎng)24 h，形成的單菌落類似圓形，邊緣不規(guī)則，有隆起，表面皺褶，不透明，干燥，菌落近白色。菌株XAL03的形態(tài)、生理生化特征（表2）與Bacillus amyloliquefaciens P1接近。

2.3系統(tǒng)發(fā)育分析

提取拮抗菌株XAL03的16S rDNA進行基因測序，將核酸序列提交到NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫進行同源性比對（Blastn）。結(jié)果顯示，菌株XAL03的序列和Bacillus amyloliquefaciens（AB255629）的序列相似性達到99.73%。選取同源性97%以上相近種屬菌株的16S rDNA基因序列進行比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖1。菌株XAL03同解淀粉芽孢桿菌屬于同一個聚類。

2.4菌株XLA03的培養(yǎng)基優(yōu)化

2.4.1單因素優(yōu)化 以NB培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基 （CK）， 對碳源、氮源、無機鹽進行單因素等量替代，通過發(fā)酵培養(yǎng)測定XAL03的生物量。在相同條件下培養(yǎng)48 h后進行比較，不同碳源和氮源條件下XAL03生長情況也就不一樣（表3）。XAL03生物量由大到小所對應的碳源分別為玉米淀粉 、麥芽糖、乳糖 、蔗糖、CK，生物量由大到小所對應的氮源分別為豆粕、玉米漿 、大豆餅粉、 酵母粉 、CK。以玉米淀粉為碳源時，其培養(yǎng)液的OD600 nm達到3.57，以豆粕為氮源時OD600 nm達到11.57，因此，確定生物量達到最大的玉米淀粉和豆粕分別作為后續(xù)試驗的碳源和氮源。對最佳碳源、氮源分別設置不同用量進行XAL03發(fā)酵培養(yǎng)，比較生物量大小。結(jié)果（表4）表明，玉米淀粉用量40 g/L、豆粕用量20 g/L時發(fā)酵液中XAL03的生物量達到最大。

設置不同磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸錳含量的培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)48 h后分別測定XAL03的生物量。結(jié)果（表5）表明，磷酸氫二鉀用量1.5 g/L、硫酸鎂用量0.75 g/L、硫酸錳用量0.010 g/L時，菌體的生物量達到最大值。

2.4.2培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件正交試驗優(yōu)化為了進一步對發(fā)酵培養(yǎng)基配方進行優(yōu)化，采用Minitab 15.0軟件設計培養(yǎng)基配方的4因素3水平正交試驗（表6），考察培養(yǎng)基配比對生物量的影響。結(jié)果見表7。

由表7可見，各因素影響XAL03生物量的主次順序為B、D、A、C，最優(yōu)組合為A3B3C2D1。結(jié)合“2.4.1”的試驗結(jié)果，最終得到優(yōu)化的培養(yǎng)基各成分用量為玉米淀粉 15.0 g/L、豆粕50.0 g/L、K2HPO4·3H2O 1.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.75 g/L、MnSO4·H2O 0.010 g/L。

培養(yǎng)條件的優(yōu)化選擇起始pH、接種量和裝液量（250 mL三角瓶）進行正交試驗（表8），結(jié)果見表9。由表9可知，各因素影響XAL03生物量的主次順序為B、C、A，最優(yōu)組合為A1B2C1。由正交試驗結(jié)果得到優(yōu)化的培養(yǎng)條件為起始pH 7.0、接種量5%、裝液量20 mL/250 mL。在優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件下，解淀粉芽孢桿菌XAL03生物量最高，為150.50×108 CFU/mL。

3小結(jié)與討論

用煙草青枯病菌作初步拮抗測定，根據(jù)抑菌圈篩選出拮抗能力較強的菌株XAL03，對其生理生化指標和16S rDNA序列進行分析，初步鑒定為解淀粉芽孢桿菌。

生防菌制劑的規(guī)模生產(chǎn)往往需要考慮成本因素。對于培養(yǎng)基的選擇應該遵循原料來源豐富、價格低廉的原則。通過單因素試驗和正交試驗相結(jié)合，得到了生物量較高的培養(yǎng)基配方為玉米淀粉 １５．０ ｇ／Ｌ、豆粕５０．０ ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４·３Ｈ２Ｏ １．０ ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４·Ｈ２Ｏ ０．７５ ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４·Ｈ２Ｏ ０．０１０ ｇ／Ｌ；優(yōu)化得到發(fā)酵條件為接種量５％、初始ｐＨ ７．０、裝液量２０ ｍＬ／２５０ ｍＬ，ＸＡＬ０３的生物量為１５０.50×１０8 ＣＦＵ／ｍＬ。后續(xù)研究得到最優(yōu)發(fā)酵條件為接種量１％、初始ｐＨ ７．０、裝液量２０ ｍＬ／２５０ ｍＬ， 在此條件下，芽孢形成達９４％以上，生物量比出發(fā)培養(yǎng)基提高了６．０倍，達到１．０７×１０１０ ＣＦＵ／ｍＬ。

拮抗微生物能夠在葉圍及根際生存、定殖，在植物體表占據(jù)有利的空間，與病原物進行空間及營養(yǎng)的競爭，同時還能分泌拮抗物質(zhì)，如幾丁質(zhì)酶、抗生素、細菌毒素等，這些物質(zhì)能抑制甚至殺死病原菌［１７，１８］，菌株ＸＡＬ０３的生防機理還有待進一步研究。本研究篩選出解淀粉芽孢桿菌ＸＡＬ０３在煙草青枯病的防治中存在潛在的重大應用價值，優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方對其生物菌劑的生產(chǎn)具有重要意義。

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