王 芳，李曉靜，周延清

(1．中州大學 a.實驗管理中心 b.化工食品學院，鄭州450044；2．河南師范大學 生命科學學院，河南 新鄉(xiāng)453007)

隨著生物工程及基因工程技術的發(fā)展，基于PCR(聚合酶鏈式反應)的分子標記技術也得到了迅速發(fā)展。目前在大豆種質(zhì)資源研究方面應用的PCR分子標記主要有RAPD、ISSR、AFLP、RFLP等。這些標記雖然各有特點，但是效果[1]均不理想。2001年由美國加州大學蔬菜作物系Li和Quiros[2]博士提出相關序列擴增多態(tài)性(Sequence-Related Amplified Polymorphism，SRAP)分子標記，該標記是一種新型的分子標記技術，因其具有簡便、中等產(chǎn)量、高共顯性、重復性、易于分離條帶及測序等優(yōu)點，目前在很多植物中都得到了廣泛的應用[3-4]，但在大豆研究[5]中未見報道。

聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)技術是一種檢測靈敏度和分辨率都很高的電泳技術，從聚丙烯酰胺凝膠中得到的DNA 純度很高，特別適合于像SRAP這樣的小DNA 片段的分析(5～500bp)，是分子生物學、生物工程及基因工程研究方面不可缺少的實驗技術。因其具有設備相對簡單，操作比較方便，時間短，樣品量少等特點[6]，近年來被廣泛應用于DNA的分析實驗中。本文以大豆為實驗材料，進行了大豆的SRAP-PCR擴增，并對產(chǎn)物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染，建立了一種簡便快捷的適合于大豆SRAP標記的PAGE銀染檢測方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

實驗材料為豆科大豆屬的133種大豆，品種由河南農(nóng)業(yè)科學院梁鳳珍、王樹峰和周口農(nóng)業(yè)科學院苑寶軍研究員提供(見表1)。SRAP引物由上海生物工程技術服務有限公司合成(見表2)。

1.2 DNA提取及檢測

將大豆下胚軸研磨成粉末，每個品種取3 g大豆粉末用CTAB法[7]提取總DNA。用紫外分光光度計測定所提DNA的濃度，并稀釋為10 ng/μL的工作液，保存在4 ℃冰箱中備用。

1.3 SRAP-PCR反應體系

參考Li和Quiros的SRAP擴增程序[2]稍加修改，反應體系總體積為25 μL，每管中還含有1×PCR buffer和滅菌水。進行優(yōu)化實驗，建立反應體系。PCR反應程序為：94 ℃預變性3 min，然后前5個循環(huán)為94 ℃變性l min，35 ℃ 退火l min，72 ℃延伸1 min，后35個循環(huán)僅將退火溫度升為50 ℃，最后72 ℃延伸7 min[8]。

1.4 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳[9-10]

1.4.1 聚丙烯胺凝膠的配制

10 %過硫酸胺(APS)：1 g過硫酸胺溶于10 mL雙蒸水，4 ℃保存。6%丙烯酰胺凝膠母液：29 g丙烯酰胺，5.8 g甲叉雙丙烯酰胺，加雙蒸水至500 mL，溶解后過濾，4 ℃保存。10 TBE(pH8.0)：108 gTris堿，55 g硼酸，40 mL 0.5 mol/L EDTA。

表1 用于SRAP分析的大豆品種名稱

表2 用于大豆研究中SRAP引物

1.4.2 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳步驟

首先用洗滌劑將兩塊玻璃徹底清洗干凈，晾干。用2 mL左右的95 %乙醇涂于玻璃板上，擦拭干凈，可處理1～2次。裝配好垂直電泳板，兩塊玻璃板的兩側及底部用1%的瓊脂糖封邊。將裝好的玻璃電泳板傾斜45～60°。其次，在70 mL丙烯酰胺凝膠母液中加入400 μL APS和40 μL TEMED，配制成凝膠液混勻，緩慢將凝膠液注入兩玻璃板空隙中，直至灌滿至模具的頂部。將梳子小心地插入，以免梳齒下或梳齒旁產(chǎn)生氣泡，梳頂部應該比短玻璃板頂部稍高些。室溫聚合1 h后，將玻璃板插入電泳槽中，固定，倒入0.1×TBE緩沖液。小心取出梳子，加樣，上樣量為6 μL PCR產(chǎn)物。最后，撕取膠帶小心拔出梳子。在下槽加入400 mL左右1倍TBE后，將凝膠模具裝上電泳裝置。上槽加入500 mL 1倍TBE。上樣過程盡可能迅速，爭取在30 min內(nèi)完成。上樣完畢繼續(xù)在140 V恒壓下電泳約4 h，當二甲苯青距底部約1/3處終止電泳[5]。

1.5 染色

1.5.1 染液的配制

固定液：加100 mL無水乙醇和5 mL冰醋酸至1790 mL雙蒸水中。染色液：加入100 mL無水乙醇和5 mL冰醋酸至1790 mL雙蒸水中，再加入2 g AgNO3。顯色液：將30 g NaOH溶于1L雙蒸水中，在4～10 ℃下冷卻。在使用前幾分鐘，加入3 mL甲醛。停顯液：加200 mL的冰醋酸至1800 mL的雙蒸水中[5]。

1.5.2 染色的操作步驟

固定和染色：將凝膠放入準備好的裝有固定液的塑料盒中，靜置10 min以上。將顯色液放于冰浴中進行冷卻，染色將要結束時，在清洗塑料盒中加入雙蒸水。將6 mL 37%甲醛加入冷卻好的顯色液中，混勻，將2 L配好的顯色液倒入顯影塑料盒中。

漂洗和顯色：將凝膠從染色液中取出，在清洗盒中迅速漂洗一遍，時間嚴格控制在5～10s。將凝膠放入顯色液中，輕輕搖動至第一條帶出現(xiàn)，倒掉已上色的顯色液，更換另一半顯色液，繼續(xù)輕輕搖動。一般上部顯色，應對帶弱的部分尤其是下部著重進行顯色，至直條帶清晰可見。輕輕搖動2 min后，再將玻璃板用雙蒸水漂洗3 min。

停顯和晾干：將凝膠從顯色液中取出，在清洗盒中迅速漂洗一遍，放入10 %的停顯液中，然后拍照或掃描保存[5]。

2 結果

2.1 引物篩選結果

對大豆品種進行引物篩選(見圖1)，結果從288對隨機引物組合中篩選出條帶較多、信號強、背景清晰的12對引物組合(見表3)用于進一步分析研究。

圖1 SRAP部分引物的篩選(編號為引物序號)

2.2 大豆的SRAP-PCR擴增

用篩選出來的引物組合me16em17和me12em5對大豆SRAP的產(chǎn)物進行了擴增，擴增產(chǎn)物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳技術檢測，并用銀染法進行染色(見圖2、圖3)。實驗結果表明，對于大豆SRAP分子標記來說，采用聚丙烯凝膠電泳及銀染法染色，取得了比較理想的電泳條帶及染色效果。由此可見，此種方法檢測大豆SRAP標記，具有檢測靈敏度高、凝膠背景淺、操作簡便、條帶清晰等特點，是適合大豆SRAP研究的檢測方法。

表3 用于SRAP研究的引物組合及擴增結果

圖2 引物me16em17 SRAP的PAGE擴增圖譜

圖3 引物me12em5 SRAP的PAGE擴增圖譜

3 結論與討論

SRAP分子標記因其具有操作簡便、穩(wěn)定、產(chǎn)率高、便于克隆目標片段的優(yōu)點，已經(jīng)被廣泛應用于水稻、萵苣、馬鈴薯、白菜、大蒜、油菜、蘋果、生菜、櫻桃、柑橘、芹菜等作物的種質(zhì)資源的鑒定評價、遺傳圖譜的構建、重要性狀基因標記、基因組DNA與cDNA指紋分析、比較基因組學遺傳多樣性分析和圖位克隆等[11]方面。聚丙烯酰胺凝膠電泳分辨率很高，長度僅相差0.2 %的DNA分子片段即可分開，所能裝載的DNA量遠遠超過了瓊脂糖凝膠電泳。多達10 g的DNA可以加樣聚丙烯酰胺凝膠的一個標準樣品槽而不會顯著影響其分辨力。從聚丙烯酰胺凝膠中回收的DNA純度非常高，以至于可以用于要求最高的實驗中。聚丙烯酰胺凝膠電泳的很多優(yōu)點也多用于同工酶的酶譜分析[12]。但是對聚丙烯凝膠電泳結果影響的因素很多，不同的試驗處理對結果有不同的影響，影響大的甚至不能進行試驗結果的分析。因此，需要對聚丙烯酰胺凝膠電泳各個參數(shù)進行不斷優(yōu)化。例如聚丙烯酰胺凝膠的濃度、染色過程及電泳時間等[13]都是其中重要的參數(shù)。

在用聚丙烯酰胺檢測SRAP-PCR產(chǎn)物時，前人多采用4%～10%之間的濃度進行檢測。張素勤[14]在檢測辣椒SRAP產(chǎn)物時應用10 %的凝膠濃度，許曉燕[15]等利用AFLP和SRAP標記分析毛木耳的遺傳多樣性時用8 %的聚丙烯凝膠，何鳳發(fā)[16]用9 %的凝膠濃度對馬鈴薯進行了遺傳資源多樣性的分析，王華忠[10]用6 %的變性凝膠電泳檢測。本文通過一系列實驗建立了適合大豆SRAP聚丙烯酰胺凝膠電泳及染色方法，即聚丙烯酰胺凝膠的濃度為6%、電泳電壓為140 V， SRAP標記產(chǎn)物多態(tài)性條帶清晰、明亮、穩(wěn)定，為大豆SRAP進一步的研究工作提供了理論依據(jù)和技術支持。

參考文獻：

[1]李嚴，張春慶. 新型分子標記：SRAP技術體系優(yōu)化及應用前景分析[J]. 中國農(nóng)學通報，2005， 21(5): 108-112.

[2]Li G, Quiros C F. Sequence-related amplified polymorphism (SRAP), a new marker system based on a simple PCR reaction its application to mapping and gene tagging in Brassica [J]. Theor Appl Genet, 2001,103:455-461.

[3]Zhou Anqing,Gu Fengping,Zhou Chun,et al.Genetic diversity of Rehmannia glutinosa cultivars based on sequence-related amplified polymorphism markers[J]. Scientia Horticulturae, 2010,125:789-794.

[4]周延清，楊清香，張改娜．生物遺傳標記與應用[M]．北京:化學工業(yè)出版社，2008.

[5]王芳，徐翔，李領川，等.大豆種質(zhì)資源SRAP分子標記中的引物篩選[J].生物技術通報， 2012(7):73-78.

[6]宋顯軍，張偉，曹萍，等．大豆SSR標記PAGE銀染方法的改進[J]．安徽農(nóng)業(yè)科學，2006，34(16) ：3922-3923.

[7]王關林，方宏筠．植物基因工程原理和技術[M]．北京：科學出版社，1998.

[8]應正河，吳小平，謝寶貴，等．香菇SRAP反應體系的優(yōu)化[J]．食用菌學報，2006，13(4)：10-15.

[9]肖理慧．蘆筍和葎草性別連鎖的AFLP分子標記[D].河南師范大學, 2008.

[10]王華忠，吳則東，王曉武，等．利用SRAP與SSR標記分析不同類型甜菜的遺傳多樣性[J]．作物學報，2008,34(1)：37-46.

[11]Li G, Gao M, Yang B, et al. Gene for gene alignment between the Brassica and Arobidopsis genomes by direct transcriptome mapping[J]. Theor Appl Genet, 2003, 107: 168-180.

[12]宮紀娟，金喜軍，龔振平，等．春大豆莢果發(fā)育過程中酯酶同工酶酶譜分析[J]．作物雜志，2010(4)：39-42.

[13]吳娟，方慧玲，蔡兵．聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測水稻SSR標記[J]．安慶師范學院學報：自然科學版，2010，16(3)：91-93.

[14]張素勤，耿廣東，周賢婷，等．辣椒種質(zhì)資源的表型和SRAP分析[J]．山地農(nóng)業(yè)生物學報，2008，27(3)：228-232.

[15]許曉燕，余夢瑤，羅霞，等．利用AFLP和SRAP標記分析19株毛木耳的遺傳多樣性[J]．西南農(nóng)業(yè)學報，2008，2l(1)：121-124.

[16]何鳳發(fā)，楊志平，張正圣，等．馬鈴薯遺傳資源多樣性的SRAP分析[J]．農(nóng)業(yè)生物技術學報，2007，15(6)：1001-1005．