常 晨，多立安，趙樹蘭

（天津師范大學(xué)a.生命科學(xué)學(xué)院，b.天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300387）

天津污灌區(qū)土壤中重金屬嚴(yán)重超標(biāo)[1]，土壤修復(fù)工作迫在眉睫.目前，在重金屬污染土壤修復(fù)中，植物因具有良好的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)和環(huán)境綜合效益，適用于大規(guī)模污染土壤的修復(fù).利用植物修復(fù)土壤的研究也有一些報(bào)道[2-3]，如高羊茅對(duì)重金屬污染土壤就有一定的修復(fù)作用[4].有研究認(rèn)為添加螯合劑能促進(jìn)植物提取更多的重金屬[5-6].微生物修復(fù)技術(shù)在治理重金屬污染方面也有很多優(yōu)勢(shì)，如成本低、環(huán)境友好、無(wú)二次污染等[7-9].城市污泥的化學(xué)組成一般都含有一定量的Cu、Pb、Zn、Ni、Cr、Cd、Hg 等重金屬[10].從城市污泥中提取的微生物，很可能對(duì)重金屬具有抗性，可以嘗試用于重金屬修復(fù).本課題組將螯合劑氨三乙酸（NTA）、城市污泥中提取的微生物和高羊茅三者聯(lián)合起來(lái)，研究螯合劑和微生物對(duì)高羊茅修復(fù)重金屬污染土壤的強(qiáng)化作用.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

選用草坪植物高羊茅（Festuca arundinacea L.）為實(shí)驗(yàn)材料.

污泥取自天津市紀(jì)莊子污水處理廠，采用稀釋分離法分別制備細(xì)胞濃度 10-3、10-4、10-5、10-6/L 的污泥懸浮液，根據(jù)所分離的微生物，取相應(yīng)濃度的污泥懸浮液，搖勻后吸取0.2 mL加入到預(yù)先制好的平板中（真菌用馬丁氏瓊脂平板，放線菌用高氏一號(hào)瓊脂平板，細(xì)菌用牛肉膏蛋白胨平板），用滅菌的涂布器涂抹均勻，每個(gè)處理重復(fù)3次，28℃培養(yǎng).根據(jù)平板內(nèi)菌落的形態(tài)、大小、色澤和生長(zhǎng)速度等，從每個(gè)樣品中盡可能多地挑取單菌落劃線純化.依據(jù)菌落性狀和形態(tài)特征對(duì)菌株歸類和統(tǒng)計(jì)數(shù)量，確定相應(yīng)的優(yōu)勢(shì)菌，對(duì)其編號(hào)并保存.對(duì)優(yōu)勢(shì)菌進(jìn)行基因擴(kuò)增后，送至上海美吉基因公司測(cè)序.在NCBI網(wǎng)站上，采用BLAST軟件將測(cè)序結(jié)果與GenBank核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中相關(guān)種屬的16S rDNA和18S rDNA序列進(jìn)行同源性比較.最終確定本研究所用菌種為施氏假單胞菌、里氏木霉和灰黃鏈霉菌，將這3種微生物按體積比1∶1∶1的比例混合，配制成復(fù)合微生物菌液.

選用氨三乙酸（NTA）作為螯合劑，分析純，由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn).

供試土壤取自天津市西青區(qū)污灌區(qū).將采集的土壤去除草根、石塊后，放置于通風(fēng)處，自然風(fēng)干2～3 d后，過(guò)2 mm篩備用.土壤理化性質(zhì)測(cè)定參考文獻(xiàn)[11].土壤有機(jī)質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.62%，全氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.19%，全磷量為5.4 g/kg，全鉀量為787.3 mg/kg，pH為7.28，土壤含水量為4.13%，電導(dǎo)率為0.44 mS/cm.每千克土壤中 Cd、Cu和 Zn的含量分別為 7.13、146.31和795.56 mg，分別是土壤環(huán)境質(zhì)量二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（GB156182-1995）的 23.8、1.5和 3.2倍.

1.2 土壤處理

供試土壤共設(shè)置8個(gè)處理，分別標(biāo)記為：（Ⅰ）不加NTA和菌液的對(duì)照土壤；（Ⅱ）每千克土壤添加5 mmol NTA；（Ⅲ）每千克土壤添加10 mmol NTA；（Ⅳ）每千克土壤添加15 mmol NTA；（Ⅴ）土壤中只加菌液；（Ⅵ）每千克土壤中添加菌液和5 mmol NTA；（Ⅶ）每千克土壤中添加菌液和10 mmol NTA；（Ⅷ）每千克土壤中添加菌液和15 mmol NTA.每個(gè)處理重復(fù)3次.

1.3 草坪植物培養(yǎng)

以直徑為7 cm、高度為8 cm的塑料杯為培養(yǎng)容器，每杯加入170 g未添加NTA和菌液的土壤，播種0.5 g高羊茅種子.植物生長(zhǎng)15 d后，向處理V、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ中加入15 mL菌液.植物生長(zhǎng)25 d后向各組添加不同濃度的NTA，NTA處理10 d后收獲高羊茅.實(shí)驗(yàn)周期為35 d.高羊茅培養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，經(jīng)常調(diào)換位置以保證光照一致，培養(yǎng)期間室溫17～31℃，相對(duì)濕度38%～60%.培植期間正常供水.

1.4 指標(biāo)測(cè)定

生物量的測(cè)定：播種35 d后收獲高羊茅，分為地上和地下部，經(jīng)去離子水反復(fù)沖洗后，將其放入烘箱中，80℃下烘干至恒重，測(cè)其干重.

重金屬含量的測(cè)定：稱取植物樣品0.1 g，用硝酸、高氯酸、硫酸混和液（體積比8∶1∶1）消解后，所得溶液用蒸餾水定容至25 mL，用TAS-990原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定消化液中重金屬（Cd、Cu、Zn）的含量.

1.5 數(shù)據(jù)分析處理

采用SPSS17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 NTA和微生物對(duì)高羊茅生物量的影響

不同處理對(duì)高羊茅生物量的影響如表1所示.

由表1可以看出，5 mmol/kg NTA處理增加了高羊茅地上部生物量，比對(duì)照組增加4.7%；而10 mmol/kg和15 mmol/kg NTA處理則抑制了高羊茅地上部生物量的積累.添加菌液后，高羊茅地上部生物量顯著增加，尤其以單獨(dú)添加菌液的處理效果最明顯，和對(duì)照組相比，增加了27.6%，添加菌液的4個(gè)處理間的差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）.除15 mmol/kg NTA處理外，各處理組的高羊茅地下生物量均高于對(duì)照組，其中單獨(dú)添加菌液的處理對(duì)高羊茅根部生物量的積累促進(jìn)作用最明顯，比對(duì)照組提高了約50%.總之，單獨(dú)添加菌液對(duì)高羊茅生物量積累的促進(jìn)效果最好，聯(lián)合使用NTA后，高羊茅生物量的積累略有下降，但也顯著高于對(duì)照組，尤其是地上部生物量的積累.

表1 不同處理對(duì)高羊茅生物量的影響Tab.1 Effects of different treatments on the biomass of F.arundinacea

2.2 NTA和微生物對(duì)高羊茅地上部重金屬含量的影響

土壤中添加NTA和菌液后，高羊茅地上部重金屬含量的變化如表2所示.

表2 不同處理下高羊茅地上部的重金屬含量Tab.2 Heavy metal concentrations in shoots of F.arundinacea under different treatments μg/g

由表2可以看出，單獨(dú)添加NTA處理的高羊茅地上部Cd含量隨NTA濃度的增加呈上升趨勢(shì)，高濃度處理組與對(duì)照組之間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p≤0.05）.NTA+菌液的處理方式進(jìn)一步增加了高羊茅地上部分對(duì)Cd的富集，其中10 mmol/kg NTA+菌液處理組中高羊茅地上部Cd含量達(dá)到最大，是同等濃度NTA單獨(dú)處理的1.35倍.

單獨(dú)添加NTA處理的高羊茅地上部Cu含量也是隨著NTA濃度的增加而增加，但只有NTA濃度達(dá)到10 mmol/kg后，地上部Cu的含量才顯著高于對(duì)照組.NTA+菌液的處理方式也增加了高羊茅地上部對(duì)Cu的積累，但同單獨(dú)添加NTA相比，作用效果并沒(méi)有顯著提升.所有處理中，單獨(dú)添加15 mmol/kg NTA處理中高羊茅地上部Cu的積累最多.

高羊茅地上部分對(duì)Zn的積累中，隨著NTA濃度的增加，地上部Zn的含量也呈增加趨勢(shì)，15 mmol/kg NTA處理組中高羊茅地上部分Zn的含量是對(duì)照組的11倍.NTA+菌液的處理組中，5 mmol/kg NTA+菌液組中高羊茅地上部分Zn的含量最多，是對(duì)照組的15.15倍.高濃度的NTA聯(lián)合添加菌液未能顯著提升高羊茅對(duì)Zn的積累.

總的來(lái)看，單獨(dú)添加菌液處理中，高羊茅地上部Cd、Cu、Zn的含量與對(duì)照組之間的差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05），表明混合菌液對(duì)高羊茅轉(zhuǎn)運(yùn)吸收重金屬?zèng)]有顯著影響.單獨(dú)添加NTA可以提高高羊茅地上部分對(duì)重金屬Cd、Cu、Zn的積累，并且隨著NTA濃度的增加，高羊茅地上部分重金屬的含量也增加.螯合劑與菌液聯(lián)合使用后，在一定程度上提高了高羊茅地上部分對(duì)重金屬的富集能力，但對(duì)于不同的金屬，螯合劑與菌液的最佳配比也不同.

2.3 NTA和微生物對(duì)高羊茅根部重金屬含量的影響

土壤中添加NTA和菌液后，高羊茅根部重金屬含量的變化如表3所示.

表3 不同處理下高羊茅根部的重金屬含量Tab.3 Heavy metal concentrations in roots of F.arundinacea under different treatments μg/g

由表3可知，單獨(dú)添加NTA的處理中，隨著NTA濃度的增加，高羊茅根部Cd的含量也增加，但幅度不大.土壤中聯(lián)合添加菌液后，高羊茅根部對(duì)Cd的積累增加較多，高于同等濃度NTA單獨(dú)處理的效果，其中15 mmol/kg NTA+菌液處理下高羊茅根部Cd含量最大，是對(duì)照組的2.72倍.

對(duì)土壤Cu的去除效果中，單獨(dú)添加NTA時(shí)，隨著NTA濃度的增加，高羊茅根部Cu的含量顯著增加，高濃度NTA處理組同對(duì)照組之間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p≤0.05）.聯(lián)合添加菌液時(shí)，高濃度NTA處理組高羊茅根部對(duì)Cu的積累也顯著高于對(duì)照組，但15 mmol/kg NTA+菌液處理組中，高羊茅根部Cu的含量低于單獨(dú)添加同等濃度NTA的處理.

單獨(dú)添加NTA的處理組中，高羊茅根部Zn的含量也是隨著NTA濃度的增加而增加，高濃度NTA處理組同對(duì)照組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p≤0.05）.聯(lián)合添加菌液后，5 mmol/kg和10 mmol/kg NTA處理組高羊茅根部對(duì)Zn的富集增加，15 mmol/kg NTA處理組添加菌液后，高羊茅根部對(duì)Zn的富集作用反而下降.

總的來(lái)看，單獨(dú)添加菌液中，高羊茅根部對(duì)重金屬的富集作用沒(méi)有顯著提升，甚至對(duì)金屬Cu和Zn的富集作用下降；單獨(dú)添加NTA時(shí)，隨著NTA濃度的增加，高羊茅根部對(duì)重金屬的富集作用增強(qiáng)；螯合劑聯(lián)合添加菌液后，高羊茅根部對(duì)重金屬的富集效果進(jìn)一步提高，尤其是對(duì)Cd的富集作用較單獨(dú)添加NTA處理更為顯著.

3 討論與結(jié)論

在植物對(duì)重金屬污染土壤的修復(fù)過(guò)程中，添加微生物可能會(huì)提高植物的生物量.如馬文亭等[12]發(fā)現(xiàn)，在不同的Cd污染水平下，土壤中添加里氏木霉能夠增加伴礦景天的生物量，提高其對(duì)Cd的抗性和對(duì)Cd污染土壤的修復(fù)效率；Usman等[13]研究AM菌根和EDTA對(duì)玉米和向日葵吸收Pb、Zn、Cd和Cu的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，接種AM后2種植物的地上部分和根部的生物量都增加.本研究發(fā)現(xiàn)，向污灌區(qū)土壤中添加污水處理廠中分離出的菌液，高羊茅地上部和根部的生物量都顯著高于對(duì)照組和單獨(dú)添加NTA的處理，即菌液對(duì)高羊茅的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用.Quartacci等[14]的研究表明，單獨(dú)添加NTA沒(méi)有影響埃塞俄比亞芥的根長(zhǎng)和地上部/根部的質(zhì)量比.本研究中單獨(dú)添加NTA也未能顯著影響高羊茅的地上和根部生物量，而菌液與NTA聯(lián)合使用，則能顯著提高高羊茅的地上生物量.

在植物對(duì)土壤重金屬的富集作用中，有研究表明，螯合劑能活化土壤重金屬，促進(jìn)植物對(duì)重金屬的吸收和富集[15].本研究發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)添加NTA能提高高羊茅全株的重金屬含量，并且高羊茅對(duì)重金屬的積累隨著土壤中NTA含量的增加而增加.而單獨(dú)添加菌液對(duì)高羊茅富集重金屬的能力沒(méi)有顯著影響，這與翁高藝等[16]的研究一致.研究螯合劑與菌液聯(lián)合作用下高羊茅對(duì)重金屬的富集作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，針對(duì)高羊茅的不同部位和土壤中不同的重金屬，螯合劑與菌液的最佳配比也不同.對(duì)于金屬Cd，高羊茅地上部分的最佳處理是10 mmol/kg NTA+菌液，根部達(dá)到最大含量的處理方式是15 mmol/kg NTA+菌液；對(duì)于金屬Cu，全株植物都是單獨(dú)添加15 mmol/kg NTA的效果最好；對(duì)于金屬Zn，地上部分的最佳處理是5 mmol/kg NTA+菌液，根部則是單獨(dú)添加15 mmol/kg NTA的效果最好.由此可見，螯合劑與菌液共同添加對(duì)根部重金屬含量的提高有一定的局限性，可能是由于二者的聯(lián)合作用促進(jìn)高羊茅地上部生長(zhǎng)的同時(shí)，根部向地上部轉(zhuǎn)移了更多的重金屬.綜合修復(fù)效果和經(jīng)濟(jì)成本，可考慮用10 mmol/kg NTA與微生物菌液聯(lián)合使用，強(qiáng)化高羊茅對(duì)污灌區(qū)土壤重金屬污染的修復(fù)效果.

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