覃永華，徐 鑫，王春臺

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護與利用湖北省重點實驗室，武漢 430074 )

流式細(xì)胞術(shù)(FCM)是應(yīng)用流式細(xì)胞儀對處于液流中的各種熒光標(biāo)記的微粒進行多參數(shù)快速準(zhǔn)確定性、定量測定的方法，它可直接獲取細(xì)胞核DNA含量，間接獲取細(xì)胞的倍性[1-4].生物體的單倍體基因組所含DNA總量 (簡稱C值)是研究種群進化、物種分類、親緣關(guān)系和生態(tài)學(xué)的有用分析工具和證據(jù)[5]，可通過測定C值來鑒定雜交物種[6].由于植物在生長發(fā)育和抵抗外界不良環(huán)境的過程中，會發(fā)生基因組拷貝數(shù)增加[7](多倍性)和基因組擴增[8](核內(nèi)再復(fù)制)，故倍性鑒定可用于評估和分析組織細(xì)胞在不同生長環(huán)境下的細(xì)胞分裂活動.

目前，流式細(xì)胞術(shù)已廣泛應(yīng)用于植物和動物細(xì)胞核DNA含量和倍性的測定，但其在水稻中的應(yīng)用仍不成熟，由于解離液與水稻材料不匹配使解離效果不好、碎片多、大細(xì)胞易破碎，準(zhǔn)確性差.盡管已有解離液LB01和Otto成功提取水稻單一組織細(xì)胞核的實驗報道[9,10]，但由于水稻不同部位組織結(jié)構(gòu)存在顯著差異，往往需要用不同解離液解離才能獲得良好效果，因為水稻葉片表面有較厚的角質(zhì)層，纖維含量較高，細(xì)胞內(nèi)次生代謝物多，細(xì)胞核的懸液制備較困難[11].本文以3種其他物種中成功報道的分離緩沖液為參考，制備了水稻的細(xì)胞核懸液，通過比較以篩選出適用于水稻不同組織細(xì)胞核流式細(xì)胞術(shù)分析的最佳緩沖液，改善水稻細(xì)胞核分離效果，為快速、準(zhǔn)確鑒定出水稻不同組織細(xì)胞核DNA含量和倍性提供實驗依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

流式細(xì)胞儀(FACSCalibur, 美國Backman公司).以水稻(Oryzasativa. L)品種中花11為研究對象，取在MS培養(yǎng)基中正常生長2周的幼苗葉、根尖以及大田中授粉15 d后的種子為實驗材料.

細(xì)胞核分離緩沖液緩沖液I (Tris-MgCl2buffer)：200 mM Tris，4 mM MgCl2·6H2O，0.5% (v/v) TritonX-100，pH 7.5.細(xì)胞核分離緩沖液II ( Lysis buffer，LB01)：15 mM Tris，2 mM Na2EDTA，0.5 mM 四鹽酸精胺，80 mM KCl，20 mM NaCl，0.1%(v/v)TritonX-100，15 mMβ-巰基乙醇，pH7.0～8.0，-20 ℃下保存，用時解凍.細(xì)胞核分離緩沖液III (Otto buffer)︰Otto I含100 mM 檸檬酸，0.5%(v/v)Tween20，pH 2.0～3.0；OttoII含400 mM Na2HPO4·12H2O，pH 8.9.解離液的組成為V(Otto I)︰V(Otto II)= 2︰1，棄上清后加Otto I[9,10,12].

1.2 細(xì)胞核懸液制備

參考文獻[13]，取1 g 正常生長2周的水稻苗幼葉，用蒸餾水洗凈，濾紙吸干后放入預(yù)冷的培養(yǎng)皿里，加入預(yù)冷的解離液1 mL Otto buffer，用鋒利刀片快速切碎，將材料浸沒在解離液里.用400目的濾膜將浸有材料的解離液過濾到1.5 mL離心管中，置于4 ℃孵育5 min.在1000 r/min，4 ℃離心5 min.棄上清后，再加入200 μL預(yù)冷的解離液Otto I，同時加入10 μL預(yù)冷的染料1 μg/μL PI(使用濃度50 μg/mL)和1 μL的10 μg/μL RNase母液(使用濃度50 μg/mL)，每個樣品共約 200 μL細(xì)胞核懸浮液.

1.3 流式細(xì)胞術(shù)分析測定

參考文獻[14]，經(jīng)PI染色的每個樣品通過流式細(xì)胞儀測定20000個細(xì)胞核.利用CellQuest ProTM軟件獲取數(shù)據(jù)，并通過ModFit LT軟件顯示直方圖(橫坐標(biāo)以DNA相對含量，縱坐標(biāo)為細(xì)胞核個數(shù))，計算G0/1峰的變異系數(shù)[CV(%) = 標(biāo)準(zhǔn)差/平均值×100].根據(jù)未知樣本和標(biāo)準(zhǔn)樣本圖中峰值的相對位置，確定未知樣本的染色體倍性.一般CV值小于3%～5%，表示結(jié)果準(zhǔn)確.

2 結(jié)果

2.1 不同緩沖液的效果比較

不同緩沖液獲得的水稻幼葉細(xì)胞核相對DNA含量結(jié)果見圖1.由圖1可見，使用這3種緩沖液制備的水稻幼葉細(xì)胞核懸浮液，經(jīng)流式細(xì)胞儀分析測定均可產(chǎn)生非常明顯的峰，但圖1a中，在2C的主峰的左側(cè)出現(xiàn)明顯的干擾峰，同時收集到完整的細(xì)胞核相對較少.圖1b結(jié)果較圖1a好，除未見雜峰外，完整細(xì)胞核的收集也相對要多.圖1c結(jié)果最好，未見雜峰，主峰出現(xiàn)了2C和4C兩峰，并且能收集到大量的完整細(xì)胞核.緩沖液I、II、III的CV值分別為9.02 %、6.13 %、4.57 %，CV值越小，峰圖效果越好.

a) 緩沖液I；b) 緩沖液II；c) 緩沖液III圖1 不同緩沖液獲得的二周齡水稻苗幼葉細(xì)胞核相對DNA含量Fig.1 The relative DNA contents of cell nuclei isolated from young leaf of two weeks-old rice seedling by different buffer solutions

2.2 用Otto緩沖液對不同組織的鑒定效果

采用Otto buffer分離緩沖液制備水稻根尖和種子的細(xì)胞核懸浮液，基于流式細(xì)胞儀檢測DNA峰值的位置可確定樣品的倍性，結(jié)果見圖2.由圖2可見，根尖細(xì)胞的峰圖2a中出現(xiàn)了較高的2C峰外，還出現(xiàn)了較低的4C峰，橫坐標(biāo)(DNA含量)也顯示出4C是2C的兩倍.峰圖表明根尖特別是分生區(qū)細(xì)胞分裂旺盛，除了存在二倍體2C細(xì)胞外，還存在大量待分裂的四倍體4C細(xì)胞.圖2b中種子的DNA含量檢測顯示了3個峰值，分別為2C、3C和4C，其中2C含量最高，4C最少；橫坐標(biāo)所顯示的DNA含量和倍性水平是對應(yīng)的.種子中除了含有大量已分裂的二倍體細(xì)胞2C和少量待分裂的四倍體4C細(xì)胞外，由于胚乳細(xì)胞是三倍體，所以其DNA含量為3C，其DNA值也正好介于2C和4C之間.以上結(jié)果說明Otto buffers可作為一種較好的緩沖液分離完整的細(xì)胞核.

a) 根尖；b) 種子圖2 水稻根和種子細(xì)胞核相對DNA含量Fig.2 The relative DNA contents of cell nuclei isolatedfrom root and seed in rice

3 討論

流式細(xì)胞術(shù)可用于DNA含量和倍性的檢測，對研究植物進化、親緣關(guān)系和細(xì)胞分裂活動具有重要的參考意義.常規(guī)的染色體計數(shù)法測定水稻倍性不僅對技術(shù)要求很高，而且由于水稻細(xì)胞核較小或染色體對數(shù)多，要得到準(zhǔn)確的結(jié)果有很大難度.流式細(xì)胞術(shù)可很好地解決這一難題，但由于水稻組織細(xì)胞自身結(jié)構(gòu)的特異性造成了很難選取合適的解離液用于水稻不同組織細(xì)胞核DNA含量和倍性的測定[4]，故制備一種合適的緩沖液用于流式細(xì)胞檢測水稻細(xì)胞十分必要.

本文通過流式細(xì)胞技術(shù)比較了3種緩沖液制備水稻組織細(xì)胞核懸液的DNA的效果，結(jié)果表明：緩沖液III(Otto buffer)制備的細(xì)胞核懸液能成功地鑒定出水稻不同組織部位的倍性水平.同時，該緩沖液也可用于水稻根尖和種子的DNA含量和倍性的研究，為類似的研究提供了參考.但該緩沖液也存在著有不足之處，例如，在種子胚乳中應(yīng)存在6C的細(xì)胞核，但是實驗中未形成明顯的波峰，可能是緩沖液對維持細(xì)胞核的完整性不夠.不同植物的組織結(jié)構(gòu)和化學(xué)成分存在較大差異，解離液與待測植物樣本可能不匹配.當(dāng)解離液不匹配待測植物時，非但不能保持細(xì)胞核完整，還會加速細(xì)胞核破碎.故對不同植物要選擇不同的細(xì)胞核分離緩沖液，或改變緩沖液成分來維持細(xì)胞核的完整性以獲得較高分辨率.

參 考 文 獻

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