王曉煒，姜云清，張成鴻

(1.大連醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院形態(tài)實(shí)驗(yàn)室，116044，遼寧，大連;2.大連市結(jié)核病醫(yī)院檢驗(yàn)科，116033，遼寧，大連)

0 引言

翼柄山萵苣(Lactura triangulataMaxim)又稱(chēng)野生菜，為菊科苦苣菜屬2年生或多年生草本植物[1]，主要分布在我國(guó)的東北、華北等地，在遼寧地區(qū)的大連、本溪、寬甸等地也有分布，生長(zhǎng)于山坡林下和林緣草地等環(huán)境[2－3]。在遼寧的南部地區(qū)，翼柄山萵苣的嫩莖葉是民間非常受歡迎并具有一定療效作用的野菜，市場(chǎng)上也有出售。由于翼柄山萵苣的適口性好，農(nóng)民飼養(yǎng)的豬、羊、兔、雞、鴨和鵝等畜禽，也都非常喜食翼柄山萵苣的嫩莖葉。幾十年前，有的農(nóng)民發(fā)現(xiàn)，把翼柄山萵苣作為青飼料喂飼畜禽，能降低發(fā)病率，有助于提高養(yǎng)殖效益。因此，多年來(lái)遼寧南部的大連等地區(qū)的人們一直在大量的采收翼柄山萵苣作為藥用食材，或者作為青飼料喂養(yǎng)畜禽。然而，由于所采收的翼柄山萵苣必須是幼苗才能食用或飼用，由此使野生翼柄山萵苣資源遭到了嚴(yán)重破壞。致使現(xiàn)今出現(xiàn)了不僅難以采收到食用或飼用的野生翼柄山萵苣幼苗，而且每年的8－10月連野生翼柄山萵苣的種子也無(wú)法采收到的現(xiàn)象。為保護(hù)野生資源和滿(mǎn)足栽培的需求，研究者對(duì)其進(jìn)行了愈傷組織分化及試管苗培養(yǎng)的研究。盡管同屬植物已有毛脈山萵苣[4]、葉用萵苣[5－7]、結(jié)球萵苣[8]的研究報(bào)道，但卻未見(jiàn)翼柄山萵苣愈傷組織分化及試管苗培養(yǎng)培養(yǎng)的研究報(bào)告。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源及預(yù)處理

5月下旬，將在大連金州西海岸草地上生長(zhǎng)旺盛的翼柄山萵苣植株的地下部一次性澆透4 mg/L青霉素溶液，同時(shí)向植株的地上部噴灑3 mg/L青霉素與3 mg/L慶大霉素的混合溶液，進(jìn)行預(yù)先滅菌處理。1 d后，將已經(jīng)預(yù)先滅菌、待做試驗(yàn)材料的全株采回實(shí)驗(yàn)室備用。

1.2 材料滅菌

將采回實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的植株葉柄、嫩莖和粗壯根分別剪成長(zhǎng)2 cm左右的葉柄段、嫩莖段和粗壯根段，采用穿龍薯蕷研究[9]的方法進(jìn)行材料的滅菌，就會(huì)獲得無(wú)菌的葉柄段、嫩莖段和粗壯根段。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 愈傷組織培養(yǎng) 將無(wú)菌材料段從滅菌瓶中取出后，放到無(wú)菌濾紙上，在吸干多余水分的同時(shí)，將無(wú)菌材料段兩端分別切掉0.5 cm左右，使其形成長(zhǎng)約1 cm、兩端具有新鮮切口的葉柄段、嫩莖段和粗壯根段，并接種到以下6種培養(yǎng)上培養(yǎng):1)1/4 MS+瓊脂4.6 g/L+蔗糖34 g/L+ZT 0.7 mg/L+NAA 2.2 mg/L;2)1/4 MS+ 瓊脂 4.6 g/L+蔗糖34 g/L+ZT 0.7 mg/L+IAA 2.2 mg/L;3)1/4 MS+瓊脂4.6 g/L+蔗糖 34 g/L+ZT 0.7 mg/L+2，4-D 2.2 mg/L;4)MS+ 瓊脂 4.6 g/L+蔗糖 34 g/L+ZT 0.7 mg/L+NAA 2.2 mg/L;5)MS+瓊脂4.6 g/L+ 蔗糖 34 g/L+ZT 0.7 mg/L+IAA 2.2 mg/L;6)MS+瓊脂4.6 g/L+蔗糖34 g/L+ZT 0.7 mg/L+2，4-D 2.2 mg/L。接種后，分別放到無(wú)光(以下稱(chēng)暗培養(yǎng))和光照強(qiáng)度3 200 Lx(以下稱(chēng)光培養(yǎng))的條件下培養(yǎng)。進(jìn)行在不同培養(yǎng)基上、不同材料與光照條件對(duì)愈傷組織培養(yǎng)的影響試驗(yàn)。試驗(yàn)重復(fù)2次，每次重復(fù)間隔時(shí)間15 d，每種處理接種30個(gè)材料。

1.3.2 嫩莖愈傷組織的分化培養(yǎng) 把以上驗(yàn)證培養(yǎng)獲得的74塊嫩綠色的顆粒狀愈傷組織，從培養(yǎng)瓶中取出后，在無(wú)菌培養(yǎng)皿中切成邊長(zhǎng)約0.3 cm的塊狀，再接種到以MS+La(NO3)3·6H2O 0.5 mg/L+蔗糖36 g/L+瓊脂0.52 g%和 MS+La(NO3)3·6H2O 0.5 mg/L+蔗糖36 g/L+瓊脂0.52 g%+6-BA 0.5 mg/L 2 種培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，附加濃度分別為0.01mg/L、0.05mg/L、0.10 mg/L、0.15 mg/L、0.20 mg/L、0.25 mg/L、0.30 mg/L、0.35 mg/L、0.40 mg/L 的 IAA 和 NAA培養(yǎng)基上，再放到無(wú)光照(以下簡(jiǎn)稱(chēng)暗培養(yǎng))、光照強(qiáng)度2 000 Lx(以下簡(jiǎn)稱(chēng)光培養(yǎng))和光照強(qiáng)度4 000 Lx(以下簡(jiǎn)稱(chēng)強(qiáng)光培養(yǎng))的條件下培養(yǎng)，進(jìn)行不同基本培養(yǎng)基、不同生長(zhǎng)素及光照條件對(duì)愈傷組織分化的影響試驗(yàn)。該試驗(yàn)重復(fù)了1次，每種處理培養(yǎng)40個(gè)愈傷組織塊。

1.3.3 生長(zhǎng)芽試管苗培養(yǎng) 將驗(yàn)證性試驗(yàn)中獲得的362塊愈傷組織分化出的叢生生長(zhǎng)芽，采用以下3種方法處理:1)將0.5 mg/L的IAA溶液倒入具有由愈傷組織分化叢生生長(zhǎng)芽的培養(yǎng)瓶中，處理3 d后，將從生芽從基部剪下，使其形成單芽，再接種到1/2 MS+蔗糖14 g/L+瓊脂0.48 g不含生根劑的培養(yǎng)基上，進(jìn)行生根培養(yǎng)(下稱(chēng)方法1);2)將叢生生長(zhǎng)芽從基部切下后，馬上把下部切口放到IAA 1.8 mg/L的溶液中處理10 min，再接種到1/3 MS+蔗糖36 g/L+瓊脂0.52g%+IAA 0.8 mg/L的培養(yǎng)基上，進(jìn)行生根培養(yǎng)(下稱(chēng)方法2);3)將叢生生長(zhǎng)芽從基部剪下后，直接接種到1/3MS+蔗糖36 g/L+瓊脂0.52 g%+IAA 0.05 mg/L+NAA 0.15 mg/L 的培養(yǎng)基上，進(jìn)行生根培養(yǎng)(下稱(chēng)方法3)。該試驗(yàn)重復(fù)1次，每一種處理接種培養(yǎng)200個(gè)生長(zhǎng)芽。

1.3.4 試管苗移栽與定植 將2次生根試驗(yàn)分別培養(yǎng)的186株和189株(共375株)試管苗，培養(yǎng)到第28 d時(shí)，從培養(yǎng)瓶中取出，直接移栽到上面為一層厚約7 cm礱糠灰的日光溫室苗床上。移栽后的前13 d要防止直射光照、保持18～30℃的溫度和80%以上的濕度。之后按照溫室內(nèi)條件正常管理。

移栽后第35 d，一次性將溫室內(nèi)移栽成活的326株試管苗定植到大連金州西海岸的草地上，除了初期澆2次透水外，其它按照野生條件進(jìn)行管理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同材料、不同培養(yǎng)基及光照條件下對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)的影響

接種后2個(gè)月觀察表明，所有暗培養(yǎng)的材料均不能生長(zhǎng)出愈傷組織;而在光培養(yǎng)的條件下，只有在6)號(hào)培養(yǎng)基上培養(yǎng)的材料能不同程度的生長(zhǎng)出愈傷組織。由表1可見(jiàn)，在6)號(hào)培養(yǎng)基上以嫩莖段為材料的培養(yǎng)效果最好。在這種培養(yǎng)基上，以嫩莖為材料培養(yǎng)到第8 d時(shí)有的嫩莖段切口處就生長(zhǎng)出可見(jiàn)淡綠色、直徑0.1 cm左右的愈傷組織。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，生長(zhǎng)出愈傷組織的嫩莖段數(shù)不斷增加，愈傷組織塊越來(lái)越大，并且生長(zhǎng)的愈傷組織也由最初的淡綠色轉(zhuǎn)化為嫩綠色的顆粒狀。在這一試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，將100個(gè)嫩莖段接種到6)號(hào)培養(yǎng)基上，進(jìn)行了2次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果2次驗(yàn)證試驗(yàn)分別有74個(gè)和76個(gè)嫩莖段生長(zhǎng)出直徑0.9～2.2 cm的嫩綠色的顆粒狀愈傷組織。以上結(jié)果說(shuō)明，在光照的條件下，MS+瓊脂4.6 g/L+ 蔗糖34 g/L+ZT 0.7 mg/L+2，4-D 2.2 mg/L這一培養(yǎng)基是翼柄山萵苣嫩莖愈傷組織培養(yǎng)的適宜培養(yǎng)基。

表1 6)號(hào)培養(yǎng)基上不同材料對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)的影響(3次試驗(yàn)平均結(jié)果)

2.2 嫩莖愈傷組織的分化培養(yǎng)

2次愈傷組織的分化試驗(yàn)結(jié)果證明:只有在以MS+La(NO3)3·6H2O 0.5 mg/L+蔗糖36 g/L+瓊脂0.52g%為基本培養(yǎng)基、附加不同濃度IAA和強(qiáng)光培養(yǎng)的條件下，培養(yǎng)的愈傷組織塊才能分化出生長(zhǎng)芽，其余任何條件愈傷組織塊均不能分化。由表2顯示，IAA的濃度不同，分化的效果也不同。在附加濃度為0.05 mg/L IAA的培養(yǎng)基上，分化效果最好。對(duì)整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程的觀察還發(fā)現(xiàn)，在IAA的濃度為0.05 mg/L的培養(yǎng)基上，愈傷組織塊分化時(shí)間早，分化的生長(zhǎng)芽葉片伸展，呈叢生狀。在以上2次試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，又將400個(gè)愈傷組織塊1次性接種到以MS+La(NO3)3·6H2O 0.5 mg/L+蔗糖 36 g/L+ 瓊脂 0.52g%為基本培養(yǎng)基、附加濃度為0.05 mg/L的IAA培養(yǎng)基上，在光照的條件下進(jìn)行分化的驗(yàn)證性試驗(yàn)，共有362塊愈傷組織分化出叢生生長(zhǎng)芽，其它觀察統(tǒng)計(jì)的指標(biāo)也獲得了與初期2次試驗(yàn)幾近一致的結(jié)果。以上試驗(yàn)說(shuō)明:在光照強(qiáng)度4 000 Lx的條件下，翼柄山萵苣嫩莖愈傷組織生長(zhǎng)芽分化培養(yǎng)的適宜培養(yǎng)基是MS+La(NO3)3·6H2O 0.5 mg/L+蔗糖 36 g/L+ 瓊脂 0.52g%+IAA 0.05 mg/L。

表2 不同濃度IAA對(duì)愈傷組織塊分化培養(yǎng)的影響

2.3 不同處理方法對(duì)生長(zhǎng)芽試管苗培養(yǎng)的影響

用以上3種處理方法培養(yǎng)的生長(zhǎng)芽，接種28 d統(tǒng)計(jì)，結(jié)果由表3所示:3種處理方法，培養(yǎng)的生長(zhǎng)芽均能生根并生長(zhǎng)成試管苗，但用方法3對(duì)生長(zhǎng)芽進(jìn)行處理，不僅生根率和試管苗平均生根條數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)好于方法1和方法2，而且對(duì)方法3的2次重復(fù)試驗(yàn)共培養(yǎng)的375株試管苗的外觀長(zhǎng)勢(shì)也很旺盛。上述結(jié)果說(shuō)明，將叢生生長(zhǎng)芽從基部剪下后，直接接種到1/3 MS+蔗糖36 g/L+瓊脂0.52g+IAA 0.05 mg/L+NAA 0.15 mg/L 的培養(yǎng)基上，進(jìn)行生根培養(yǎng)的方法是翼柄山萵苣生長(zhǎng)芽試管苗培養(yǎng)的理想方法;也就是說(shuō)，1/3 MS+蔗糖36 g/L+瓊脂 0.52g%+IAA 0.05 mg/L+NAA 0.15 mg/L這種培養(yǎng)基是翼柄山萵苣生長(zhǎng)芽試管苗培養(yǎng)的適宜培養(yǎng)基。

表3 不同處理方法對(duì)生長(zhǎng)芽試管苗培養(yǎng)的影響(2次試驗(yàn)平均結(jié)果)

2.4 試管苗移栽與定植

35 d后統(tǒng)計(jì)，移栽的375株試管苗，成活326株，成活率為86.9%。

定植后1個(gè)月統(tǒng)計(jì)，共成活并正常生長(zhǎng)的試管苗為318株，定植成活率為97.5%。定植的試管苗根系發(fā)達(dá)，生長(zhǎng)旺盛，翌年8月開(kāi)花，野生翼柄山萵苣的植物學(xué)性狀都保持不變。

3 討論

在進(jìn)行愈傷組織分化培養(yǎng)的試驗(yàn)中，在附加了不同濃度的人工生長(zhǎng)素NAA的培養(yǎng)基上，均未見(jiàn)愈傷組織分化;而在附加了9種不同濃度的天然生長(zhǎng)素IAA的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)的愈傷組織均能不同程度分化。這一現(xiàn)象說(shuō)明，雖然NAA是愈傷組織分化培養(yǎng)研究中較為常用的生長(zhǎng)素[10]，但翼柄山萵苣愈傷組織的分化適宜生長(zhǎng)素卻是天然生長(zhǎng)素IAA。

盡管在培養(yǎng)基中附加了9種不同濃度的天然生長(zhǎng)素IAA，培養(yǎng)的愈傷組織都能不同程度分化生長(zhǎng)出生長(zhǎng)芽，但在低濃度(0.05 mg/L)IAA培養(yǎng)基中分化培養(yǎng)的效果最好。這并不能說(shuō)明翼柄山萵苣愈傷組織分化更需要低濃度(0.05 mg/L)的IAA，而實(shí)際情況是在分化培養(yǎng)過(guò)程中，嫩綠色的顆粒狀愈傷組織自身能合成部分天然生長(zhǎng)素IAA，這不僅提高了天然生長(zhǎng)素IAA的濃度，也促進(jìn)了愈傷組織分化培養(yǎng)生長(zhǎng)素的平衡，從而出現(xiàn)了理想分化培養(yǎng)效果。

注:本研究在遼寧省植物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

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