，*

（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，碳匯漁業(yè)實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266071；2.獐子島集團(tuán)股份有限公司，遼寧大連 116001）

多棘海盤(pán)車(chē)（Asterias amurensis）（以下簡(jiǎn)稱(chēng)海星）屬于棘皮動(dòng)物門(mén)（Echinodermata）、海星綱（Asteroidea）、海盤(pán)車(chē)科（Asteriidae），主要分布在我國(guó)黃海、渤海海域[1]。海星是一種底棲的海洋無(wú)脊椎動(dòng)物，掠食扇貝、牡蠣、鮑魚(yú)等海珍貝類(lèi)，對(duì)沿海的貝類(lèi)養(yǎng)殖危害巨大[2]。

海星具有發(fā)達(dá)的消化腺和生殖腺（統(tǒng)稱(chēng)為海星黃），其中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分[3]。另外，科研人員相繼從海星中分離到皂苷、甾醇、生物堿、多糖等多種結(jié)構(gòu)獨(dú)特的化學(xué)物質(zhì)[4]，這些化學(xué)物質(zhì)表現(xiàn)出降血壓、抑菌、抗病毒等多種生理和藥理活性[5]。海星在食品、動(dòng)物飼料、醫(yī)藥等領(lǐng)域均展現(xiàn)出良好的應(yīng)用潛力。然而，海星目前尚未得到有效的開(kāi)發(fā)利用，有關(guān)海星黃蛋白水解方面的研究也較少。大分子蛋白經(jīng)酶解后，更有利于后續(xù)的加工利用，為豐富海星高值化加工利用的基礎(chǔ)理論，本文以渤海產(chǎn)多棘海盤(pán)車(chē)為研究對(duì)象，研究了生物酶法在海星黃蛋白水解中的應(yīng)用效果，并采用響應(yīng)面法對(duì)酶解工藝進(jìn)行了優(yōu)化，以期為海星的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

多棘海盤(pán)車(chē)由大連獐子島集團(tuán)股份有限公司提供。

中性蛋白酶（1.3×105U/g）、菠蘿蛋白酶（5.0×105U/g）、風(fēng)味蛋白酶（1.5×104U/g）、復(fù)合蛋白酶（1.5×105U/g）購(gòu)于青島諾馬科生物科技有限公司。其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 可溶性蛋白含量測(cè)定

取5.0 mL酶解液加入等體積的三氯乙酸（TCA）溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%），靜置20 min后，12 000 r/min離心20 min。取上清液，采用雙縮脲比色法[6]測(cè)可溶性蛋白含量。

1.2.2 氨基酸態(tài)氮含量測(cè)定

參照GB/T 5009.39-2003《醬油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》，采用比色法測(cè)定[7]。

1.2.3 水解度測(cè)定

大分子蛋白通過(guò)酶的作用降解為小分子的可溶性多肽和氨基酸，使得溶解性增加，因此可以用可溶性蛋白和氨基酸含量的增加表征蛋白質(zhì)水解的程度?？偟鞍缀康臏y(cè)定采用微量凱氏定氮法[6]。

按照如下公式計(jì)算水解度：

式中：DH（degree of hydrolysis）為水解度；P2為酶解液中可溶性蛋白含量，（mg/g）；P1為水解前海星黃勻漿液中可溶性蛋白含量，（mg/g）；N2為酶解液中氨基酸態(tài)氮含量，（mg/g）；N1為水解前海星黃勻漿液中氨基酸態(tài)氮含量，（mg/g）；N0為海星黃中蛋白質(zhì)總含量，（mg/g）；9.14為氨基酸態(tài)氮與氨基酸含量之間的換算系數(shù)（以20種氨基酸平均分子量128計(jì)）。

1.2.4 氣味組成分析

采用PEN3便攜式電子鼻（德國(guó)AIRSENSE公司）檢測(cè)酶解液氣味組成。取樣品1 mL，置于20 mL頂空瓶中，加蓋密封。25℃恒溫靜置20 min，用電子鼻采集數(shù)據(jù)，采用系統(tǒng)自帶軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.2.5 水解用酶的篩選

取海星黃，加適量純凈水后勻漿。勻漿液分別添加中性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和復(fù)合蛋白酶，在各自適宜條件下，進(jìn)行水解試驗(yàn)，測(cè)定酶解液水解度和氣味組成。

1.2.6 單因素試驗(yàn)

確定試驗(yàn)用酶的基礎(chǔ)上，進(jìn)行底物質(zhì)量濃度、酶用量、水解時(shí)間、pH、溫度等單因素試驗(yàn)，考察各因素對(duì)水解度的影響。

1.2.7 響應(yīng)面分析

應(yīng)用Design Expert7.0軟件，以水解度為響應(yīng)值，基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取底物質(zhì)量濃度、酶用量和水解時(shí)間進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Design of response surface analysis

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行，試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，采用軟件SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，顯著性檢驗(yàn)采用ANOVA，以P＜0.01為極顯著，P＜0.05為顯著，P＞0.05為不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶種類(lèi)篩選

中性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和復(fù)合蛋白酶是水產(chǎn)動(dòng)物蛋白水解的常用酶[8]。固定底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%、酶用量2 000 U/g原料、水解時(shí)間90 min，4種蛋白酶在各自最適pH和溫度條件下，對(duì)海星黃進(jìn)行水解，其水解度分別為38.00%、25.64%、8.24%和27.47%。中性蛋白酶對(duì)應(yīng)的水解度相對(duì)較高。

4種蛋白酶對(duì)應(yīng)的酶解液氣味如圖1所示。

圖1 酶解液氣味組成分析Fig.1 Flavor analysis of enzymatichydrolysate

中性蛋白酶和菠蘿蛋白酶對(duì)應(yīng)的酶解液氣味組成與原液基本一致，10 個(gè)傳感器中，R（1）、R（3）、R（7）、R（9）的響應(yīng)值略有增大。而風(fēng)味蛋白酶和復(fù)合蛋白酶對(duì)應(yīng)的酶解液氣味組成與原液相差較大，其中R（6）和R（8）傳感器的響應(yīng)值明顯增大（P＞0.05）。4種蛋白酶對(duì)應(yīng)的酶解液氣味在感官上均可接受，都具有海星特有氣味且無(wú)明顯腥、臭等不良?xì)馕?。由于中性蛋白酶?duì)應(yīng)的水解度相對(duì)更高且價(jià)格便宜，因此作為后續(xù)試驗(yàn)用酶。

2.2 酶解條件單因素分析

以中性蛋白酶作為水解用酶，考察了底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)（5%～20%）、酶用量（500 U/g～8 000 U/g）、pH（6.0～8.0）、溫度（35℃～55℃）、時(shí)間（30 min～180 min）等條件對(duì)水解度的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。單因素試驗(yàn)結(jié)果表明：采用中性蛋白酶對(duì)海星黃進(jìn)行酶解，適宜的底物質(zhì)量濃度為10%左右、酶用量為2 000 U/g原料左右、pH6.5～7.5、溫度45℃、水解時(shí)間90 min左右。

圖 2 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)（a）、酶用量（b）、pH（c）、溫度（d）和水解時(shí)間（e）對(duì)水解度的影響Fig.2 Effectofsubstrateconcentration（a），dosageofenzyme（b），pH（c），temperature（d）andtime（e）onthedegreeofhydrolysis

2.3 酶解工藝的響應(yīng)面優(yōu)化

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與方差分析

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)中心組合設(shè)計(jì)原理，以水解度為響應(yīng)值，選取底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酶用量和水解時(shí)間進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Results of response surface experiment

采用Design-Expert 7軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，通過(guò)二次多元回歸擬合，得到水解度對(duì)底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)（A）、酶用量（B）和水解時(shí)間（C）的回歸方程為：DH%=0.41+0.014A+0.043B+0.069C+4.186E-003AB+7.425E-003AC+2.709E-003BC-0.056A2-0.037B2-0.043C2

對(duì)模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of the regression model

可以看出，模型的P值小于0.01，表明模型高度顯著，而失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），說(shuō)明方程對(duì)試驗(yàn)擬合較好。在所選取的因素水平范圍內(nèi)，各因素對(duì)水解度的影響均極顯著，且影響大小依次為：C水解時(shí)間＞B酶用量＞A底物質(zhì)量濃度。

2.3.2 響應(yīng)曲面圖分析

模型中AB、AC、BC交互項(xiàng)的響應(yīng)曲面圖見(jiàn)圖3，三維曲面圖越凸的位點(diǎn)表示響應(yīng)值越大[9]，可以看出AB、AC、BC 交互作用均顯著（P＜0.01），這和表 3的結(jié)果一致。

圖3 因素A（底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)）、B（酶用量）、C（時(shí)間）交互項(xiàng)的響應(yīng)曲面圖Fig.3 Interaction diagram of factor A（substrate concentration），B（enzymedosage）and C（time）

2.3.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

通過(guò)DesignExpert對(duì)回歸方程求解，得到海星黃最佳水解條件為：底物質(zhì)量濃度11.0%、酶用量（以原料計(jì)）1 768 U/g、水解時(shí)間140min，水解度的理論值可達(dá)45.67%。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，3次試驗(yàn)的均值為44.82%，與理論預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差僅為1.9%，說(shuō)明該模型適宜對(duì)海星黃酶解工藝進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

3 討論與結(jié)論

海星黃是優(yōu)質(zhì)的蛋白來(lái)源，通過(guò)酶解將大分子蛋白質(zhì)水解為小分子肽和氨基酸，一方面有助于作為食品利用時(shí)的消化吸收[10]，另一方面獲得的多肽可能具有潛在的生物活性[11]。利用酶工程技術(shù)水解海洋動(dòng)物蛋白一直是研究的熱點(diǎn)，研究領(lǐng)域主要集中在魚(yú)[12]、蝦[13]、貝類(lèi)[14]，有關(guān)海星黃酶解的研究鮮有報(bào)道。

水解度是指蛋白質(zhì)的肽鍵被裂解的程度或百分比[15]，可以表征大分子蛋白質(zhì)被降解為小分子肽或氨基酸的程度。水解度的測(cè)定可以通過(guò)滴定釋放出的質(zhì)子（如pH-state法[16]）、檢測(cè)可溶性蛋白或游離氨基酸含量的變化實(shí)現(xiàn)[17]。蛋白酶解過(guò)程中，可溶性蛋白和游離氨基酸含量可能同時(shí)增加，在酶解的不同時(shí)期兩者產(chǎn)生的速率也有差別。本文為提高數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性，同時(shí)檢測(cè)酸可溶性蛋白和游離氨基酸含量變化，將兩者含量與不溶性蛋白的比作為水解度值。

響應(yīng)面分析法在試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果表述方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[18]。本實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)面法得到的海星黃水解工藝為：底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)11.0%、酶用量（以原料計(jì)）1 768 U/g、水解時(shí)間140 min，此條件下水解度可達(dá)44%以上，所建立的二次回歸模型可較好的模擬海星黃的水解規(guī)律，對(duì)于相關(guān)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)具有一定的參考價(jià)值。

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