吳 珍，陳鳳娥

（商洛學院 生物醫(yī)藥與食品工程學院,陜西商洛726000）

商麥5226灌漿期旗葉酯酶同工酶的研究

吳 珍，陳鳳娥

（商洛學院 生物醫(yī)藥與食品工程學院,陜西商洛726000）

以商洛市不同種植區(qū)的商麥5226為材料，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳方法，對商麥5226灌漿期旗葉酯酶同工酶進行電泳分析。結(jié)果顯示：不同種植區(qū)商麥5226灌漿期旗葉共電泳出16條EST同工酶酶譜帶，其中，EST1-a、EST1-b、EST1-c、EST2-e、EST2-g、EST2-j是商麥5226穩(wěn)定的特征譜帶，可作為鑒別商麥5226的同工酶特征圖譜；商洛北部區(qū)域種植的商麥5226灌漿期旗葉EST同工酶條帶數(shù)在海拔較高種植區(qū)域相對較多，不同種植區(qū)商麥5226灌漿期旗葉酯酶同工酶均具有明顯的多態(tài)性，顯示商麥5226具有較強的適應性。

同工酶；商麥5226；旗葉；電泳

由于商洛地形、地貌復雜，氣候條件多樣[1],形成了豐富的物種資源,小麥經(jīng)過不同生態(tài)區(qū)漫長的自然和人工選擇,已適應其所存在的環(huán)境條件,形成復雜多樣的遺傳特性，不同品種間形成明顯差異[2-3]。同工酶是基因編碼的產(chǎn)物，能較好地反映物種間的遺傳差異，常被用于物種的分類、鑒定和親緣關系研究[4]。植物在逆境環(huán)境下（溫度、海拔等）為適應環(huán)境可以誘導合成新的蛋白，基因表達產(chǎn)生新的蛋白行使相同的功能，其同工酶酶譜發(fā)生變化。酯酶同工酶（EST）是一組能水解酯鍵的酶,存在于植物各部位和不同發(fā)育時期的細胞中,酯酶一般被作為研究發(fā)育時期基因表達調(diào)控的一種標志酶[5]。酯酶同工酶分析研究在植物研究中都有很廣泛的應用，酯酶同工酶也成為小麥種質(zhì)資源及其遺傳多樣性研究的很好素材，近年來有學者對小麥、玉米等農(nóng)作物進行同工酶的研究。蘭秀錦等分析了多倍體品種的酯酶同工酶酶譜的差異[6],牛國陽等分析研究了幾種小麥雄性不育系及其保持系與恢復系在旗葉和幼小穗的酯酶同工酶的差異[7]，關于商洛選育的小麥品種酯酶同工酶方面的研究未見報道，本研究旨在通過對商麥5226進行酯酶同工酶電泳分析,以探討其遺傳多樣性,為今后小麥的品種選育和適宜種植區(qū)的篩選提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗材料為商洛不同區(qū)域種植的商麥5226（由商洛學院生物醫(yī)藥與食品工程學院實驗室培育），每地隨機選取10株小麥，在灌漿期剪下小麥的旗葉，將10株小麥的旗葉混合裝入自封袋中密封，于冰盒中帶回實驗室置0℃冰箱中保存。

1.2 方法

1.2.1 酯酶的提取

取各樣品旗葉清洗干凈自然晾干，各取1 g放入預冷過的研缽中，加入2倍體積的電極緩沖液(Tris-甘氨酸，pH8.3)及適量石英砂，冰浴研磨成勻漿，3000 rpm離心20 min，上清液即為粗酶提取液，分別裝入試劑瓶標上標簽貯于4℃冰箱中備用。

1.2.2 電泳及染色

電泳：采用不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳法，上樣酶量30 μL，在濃縮膠（濃度為4%）里穩(wěn)流20 mA，進入分離膠（濃度為8%）后穩(wěn)流40 mA，待溴酚藍行至距分離膠邊緣約1 cm處時，停止電泳。

酯酶同工酶(EST)染色：染色法參照胡書能等[8]方法稍加改進，取100 mg堅牢藍RR鹽、50 mg α-醋酸萘酯和50 mg β-醋酸萘酯用10 mL丙酮溶解，再加入90 mL的0.1 mol·L-1pH6.5磷酸緩沖液搖勻，待溶液為磚色便可以使用，現(xiàn)配現(xiàn)用，待出現(xiàn)清晰酶帶時即可停止染色,保存在7%的醋酸溶液里，用膠片觀察燈對酶譜進行觀察、比較和記錄,然后照相。

1.2.3 實驗數(shù)據(jù)處理

繪酶譜圖并計算相對遷移率(Rf)值和同工酶酶譜間相似系數(shù)，Rf=酶帶遷移距離/溴酚藍遷移距離[9]，酯酶譜間相似系數(shù)計算[10]：計算公式c= 2w/(a+b)，其中c為酶譜間相似系數(shù)，w為A和B兩個分類群相同的酶帶數(shù)，a為分類群A在酶譜中的酶帶數(shù)，b為分類群B在酶譜中的酶帶數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 酯酶同工酶酶帶譜分析

由圖1和圖2及表1可以看出，7個不同種植區(qū)商麥5226的旗葉共電泳出16條譜帶，鎮(zhèn)安、柞水譜帶數(shù)量最少為9條，商州、丹鳳、山陽最多為15條帶。對7個不同種植區(qū)商麥5226酯酶同工酶酶譜進行分析可知，譜帶共分為3個區(qū)，即：1區(qū)（0-0.182）、2區(qū)（0.182-0.545）和3區(qū)（0.545-0.727），3個主帶區(qū)共有16條譜帶，擬解釋為3個基因位點、16個等位基因（表1），其中EST1包括EST1-a、EST1-b、EST1-c、EST1-d 4個等位基因，EST2包括EST2-a、EST2-b、EST2-c、EST2-d、EST2-e、EST2-f、EST2-g、EST2-h、EST2-i、EST2-j10個等位基因，EST3包括EST3-a、EST3-b2個等位基因，其中EST1-a、EST1-b、EST1-c、EST2-e、EST2-g、EST2-j是7個不同種植區(qū)域所有樣品中均含有的譜帶，為商麥5226EST同工酶譜中穩(wěn)定的特征譜帶，可作為鑒別商麥5226酯酶特征譜帶。

圖1 不同種植區(qū)商麥5226酯酶同工酶凝膠電泳圖譜

圖2 不同種植區(qū)商麥5226酯酶同工酶模式圖譜

表1 不同種植區(qū)商麥5226酯酶同工酶酶譜Rf值

2.2 酯酶同工酶多態(tài)性及活性分析

由表2可以看出，商洛不同種植區(qū)商麥5226酯酶同工酶具有較明顯的多態(tài)性，各種植地酯酶同工酶多態(tài)性位點的比例均大于56.25%，其中商州、丹鳳種植地樣品中酯酶同工酶多態(tài)性位點最多。由圖1和圖2還可以看出，除鎮(zhèn)安（700 m）條帶數(shù)較少外，海拔較高的種植區(qū)（洛南789 m，商州704 m，丹鳳680 m，山陽684 m）樣品酶帶數(shù)相對較多，商州、丹鳳、山陽的強帶譜最多，而海拔低的種植區(qū)（商南670 m，柞水650 m）酶帶數(shù)相對較少且染色相對較淺，綜合表明這些高海拔種植區(qū)的小麥由于環(huán)境因素而促進了酯酶同工酶基因的表達，因而同工酶種類和表達量都多，其較強的適應性與酯酶的表達有一定的相關性。

表2 不同種植區(qū)商麥5226酯酶同工酶多態(tài)位點比例

2.3 酯酶同工酶相似性分析

從表3可知，不同種植區(qū)商麥5226的酯酶同工酶酶譜間相似系數(shù)變化較大，相似系數(shù)為0.571-1，其中商州、丹鳳、山陽三者之間以及鎮(zhèn)安與柞水間的相似系數(shù)最高為1，洛南與商州、丹鳳、山陽間相似系數(shù)為0.929，洛南與鎮(zhèn)安、柞水間都為0.818，商南與商州、丹鳳、山陽三種植區(qū)域間均為0.815，鎮(zhèn)安、柞水與商州、丹鳳、山陽間均為0.750，而商南與鎮(zhèn)安、柞水間最低為0.571，對于同一品種商麥5226，不同種植區(qū)小麥旗葉酯酶酶譜間出現(xiàn)如此大的差異可能與不同地區(qū)進入灌漿期時間早晚有關，成熟較早導致其旗葉酯酶表達量相應減少，鎮(zhèn)安、柞水兩種植區(qū)間的相似系數(shù)為1，這與兩縣所處的地理位置與氣候大致相同有關。

以相似系數(shù)為0.850-1表示正常適應，相似系數(shù)為0.700-0.850表示適應性較好，不同種植區(qū)的酯酶同工酶中只有商州、丹鳳、山陽三者之間以及鎮(zhèn)安與柞水間的相似系數(shù)為1，洛南與商州、丹鳳、山陽間相似系數(shù)為0.929為正常適應，其他均表現(xiàn)較高的適應性，這也表明酯酶同工酶在環(huán)境變化時能較快調(diào)整基因表達水平，使得同工酶的種類和表達量具有提高，以適應環(huán)境的變化和逆境的脅迫。

表3 不同種植區(qū)商麥5226的EST酶譜間相似系數(shù)

3 結(jié)論與討論

同工酶幾乎存在于所有生物中，在遺傳上，當一種酶同時受幾個基因控制時，更容易適應環(huán)境的變化。一個基因由于突變而無用時，其他基因的存在仍然可以產(chǎn)生類似作用的同工酶，這有助于機體適應突變的不利后果，從而幫助植物適應不同變化的環(huán)境。

從不同種植區(qū)商麥5226灌漿期旗葉酯酶同工酶酶譜結(jié)果看，商洛市六縣一區(qū)的商麥5226酯酶同工酶酶譜與一定范圍內(nèi)海拔有關，位于海拔高的種植區(qū)（洛南789 m，商州704 m，丹鳳680 m，山陽684 m）酶帶數(shù)相對較多，而對于海拔低的種植區(qū)（商南670 m，柞水650 m）酶帶數(shù)相對較少，原因可能是由于隨著海拔的升高，溫度降低，紫外線照射變強，植物體內(nèi)的水分平衡被破壞，為了適應環(huán)境酯酶同工酶基因表達新的蛋白從而使得酯酶圖譜發(fā)生變化。

商洛市六縣一區(qū)不同種植區(qū)域的商麥5226酯酶同工酶酶譜均表現(xiàn)出一定的差異性，共電泳出16條EST同工酶酶帶，其中EST1-a、EST1-b、EST1-c、EST2-e、EST2-g、EST2-j為商洛市七個不同種植區(qū)域商麥5226酯酶同工酶均含有的共同酶帶，是商麥5226酯酶同工酶穩(wěn)定的特征譜帶，可作為鑒別商麥5226的酯酶同工酶特征酶譜。

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（責任編輯：李堆淑）

Studies on the Esterase Isozymes in Flag Leaf at Grain Filling Stage of Shangmai 5226

WU Zhen,CHEN Feng-e
（College of Biopharmaceutical and Food Engineering,Shangluo University,Shangluo 726000,Shaanxi)

In order to study the growth conditions of the wheats of Shangluo 5226 in different growing areas,we study the physiological indicators of flag leaf at grain filling stage of 5226,which is a new variety of wheat and picked in six counties and one district of Shangluo.The results show that：16 bands of Esterase isozyme were detected in flag leaf of Shanamai5226 at filling stage in different locations,while EST1-a,EST1-b,EST1-c,EST2-e,EST2-g and EST2-j were the stable characteristic bands in Shangmai 5226,which can be used as the isozyme fingerprint map to itself.Bands of isozyme in flag leaf was higher in high altitude regions in northern area of Shangluo,obvious pleiomorphism existed among flag leaf in different lacations which showed Shangmai 5226 has a high adaptability.

isozyme;Shangmai 5226;flag leaf;electrophoresis

S512.1

：A

：1674-0033（2014）06-0057-04

10.13440/j.slxy.1674-0033.2014.06.017

2014-10-23

陜西省教育廳產(chǎn)業(yè)化培育項目（2010JC0T）

吳 珍，女，廣西平南人，碩士，副教授