康琳 魏金莉 胡蝶 劉佳鳳 王毅鵬 楊帥丹 龔明福

摘要：從雪膽多種組織中分離、篩選出抗MRSA的菌株，采用總DNA ERIC-PCR方法和16S rRNA基因全序列分析方法，對(duì)抗MRSA的雪膽內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果表明，雪膽內(nèi)生細(xì)菌非常豐富，分離獲得25株抗MRSA菌株。在遺傳距離為0.50時(shí)，25株菌被劃分為4個(gè)ERIC群和1個(gè)獨(dú)立成群的菌株。

關(guān)鍵詞：雪膽；內(nèi)生細(xì)菌；耐甲氧西林金黃色葡萄球菌；多樣性

中圖分類號(hào)：S567.23+9.01文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1002-1302（2014）02-303-03

收稿日期：2013-06-07

基金項(xiàng)目：四川省教育廳科研項(xiàng)目（編號(hào)：12ZA240）；樂(lè)山師范學(xué)院科研項(xiàng)目（編號(hào)：Z1160）。

作者簡(jiǎn)介：康琳（1990—），女，本科生，從事微生物資源研究。E-mail：947531778@qq.com。

通信作者：龔明福，教授，博士，從事微生物資源及微生物與植物間相互關(guān)系研究。E-mail：gongmingfu98@163.com。雪膽（Hemsleya sinesis Cogn.） 為葫蘆科雪膽屬植物，含多種活性成分，具有多種藥理作用，包括抗腫瘤[1]、改善微循環(huán)、廣譜抗菌[2]、抗病毒[3]、保護(hù)肝臟[4]、治療胃腸疾病[5]、降溫[2]、抗炎鎮(zhèn)咳[6]等作用，被廣泛應(yīng)用于臨床，是一種具有發(fā)展前景的中藥[7]。目前，對(duì)雪膽的研究取得了一定進(jìn)展，如雪膽有效成分的提取工藝、作用機(jī)制、檢測(cè)方法的建立等。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）為醫(yī)院內(nèi)感染的多重耐藥性病原菌[8]，只對(duì)萬(wàn)古霉素敏感[9]，目前幾乎所有國(guó)家都已有MRSA的報(bào)道，我國(guó)各大醫(yī)院MRSA的分離率也很高[10]，近年來(lái)在全世界蔓延的速度比較快。MRSA除對(duì)甲氧西林耐藥外，還對(duì)臨床上廣泛應(yīng)用的多種抗生素耐藥，導(dǎo)致感染呈散發(fā)性或暴發(fā)性流行，成為全世界范圍抗細(xì)菌感染中的難題，已引起醫(yī)藥界專家與制藥企業(yè)高度關(guān)注，因此，解決MRSA耐藥性問(wèn)題，即研發(fā)新的抗MRSA藥物已經(jīng)成為當(dāng)今非常重要的任務(wù)。根據(jù)相似性原理，生活在藥用植物組織中的內(nèi)生細(xì)菌能產(chǎn)生與藥用植物相似的活性成分。劉佳等篩選到1株具有抗MRSA活性的枯草芽孢桿菌，該菌產(chǎn)生的胞外抑菌物質(zhì)對(duì)MRSA具有較好的抑制效果[11]。雪膽抗菌譜廣，其內(nèi)生細(xì)菌具有抗MRSA的潛力，因此從雪膽內(nèi)生細(xì)菌中篩選抗MRSA菌株并通過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)抗MRSA藥物具有重要的意義和發(fā)展?jié)摿Α?/p>

1材料與方法

1.1培養(yǎng)基

NA培養(yǎng)基：牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、瓊脂 18 g、水1 000 mL，pH值 7.2～7.4；PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯 200 g、葡萄糖20 g、瓊脂18 g、水1 000 mL，pH值自然，121 ℃滅菌30 min。

1.2雪膽內(nèi)生細(xì)菌的分離純化

從峨眉山采集生長(zhǎng)健康的雪膽，從其根莖組織中分離內(nèi)生細(xì)菌。將待分離的新鮮雪膽根莖組織用自來(lái)水沖洗干凈，并稱取樣品1 g，先用75%乙醇浸泡消毒5 min，再用2%次氯酸鈉進(jìn)行表面消毒5 min，最后用無(wú)菌水沖洗3～5次；沖洗干凈之后，每種樣品中加入10 mL無(wú)菌水，放在無(wú)菌研缽中研磨，靜置20 min，取上清液按倍比稀釋法系列稀釋1 000倍后，取梯度稀釋液0.1 mL涂布于平板上，每個(gè)處理重復(fù)3次，于28 ℃下暗培養(yǎng)72 h；最后一次沖洗的無(wú)菌水涂布在NA培養(yǎng)基上，于28 ℃下暗培養(yǎng)72 h，觀察是否有菌落長(zhǎng)出，進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)。

等菌落長(zhǎng)出后觀察菌落形態(tài)和菌體形態(tài)（包括大小、形狀、顏色、表面光澤、透明度、質(zhì)地、革蘭氏染色反應(yīng)、有無(wú)芽孢等），分別挑取不同的菌落，然后在培養(yǎng)基平板上純化，將純化后的內(nèi)生細(xì)菌用相應(yīng)的培養(yǎng)基斜面及甘油管于4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3抗MRSA內(nèi)生細(xì)菌的篩選

1.3.1初篩在平板表面涂布MRSA，晾干，取活化的內(nèi)生細(xì)菌菌液一環(huán)點(diǎn)接到NA平板上；取無(wú)菌水代替內(nèi)生細(xì)菌菌液點(diǎn)接到涂有指示菌MRSA的NA平板上培養(yǎng)，作為空白對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次。將平板置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h，測(cè)定抑菌圈直徑并記錄試驗(yàn)結(jié)果。

1.3.2復(fù)篩在平板表面涂布MRSA，晾干，然后在平板上距離平板中心1.5 cm處放入牛津杯，吸取100 μL初篩的具有抑菌作用的內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵液，加入到牛津杯中，用萬(wàn)古霉素代替內(nèi)生細(xì)菌菌液作為陽(yáng)性對(duì)照，每處理重復(fù)3次。將平板置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，測(cè)量抑菌圈直徑。

1.4拮抗性雪膽內(nèi)生細(xì)菌ERIC-PCR分析

拮抗性內(nèi)生細(xì)菌基因組總DNA的提取方法參見(jiàn)徐琳等的方法[12]，特異性引物選取ERIC1R（5′-ATGTAAGCTCCCTGGGGATTCAC-3′）和ERIC2L（5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′）[13]，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。反應(yīng)總體系為25 μL，其組成為 10×Buffer 2.5 μL、25 mmol/μL MgCl2 2.0 μL、2.5 mmol/L dNTP 2.0 μL、20 pmol/μL ERIC1R 0.5 μL、20 pmol/μL ERIC2L 0.5 μL、13 μL ddH2O、模板總DNA（40～80 ng/μL）4.0 μL。ERIC-PCR反應(yīng)程序參照馬溪平等的方法[13]。反應(yīng)結(jié)束后取出PCR小管，用1%瓊脂糖凝膠電泳3.5 h，利用凝膠成像系統(tǒng)儀拍照并保存圖譜，凝膠圖像經(jīng)電腦掃描處理后，在同一位置有帶的記為“1”，沒(méi)有的記為“0”。采用DPS軟件，用遺傳距離按類平均連鎖聚類法（UPGMA）進(jìn)行0-1系統(tǒng)聚類分析，得出樹(shù)狀圖[14]。

2結(jié)果與分析

2.1雪膽內(nèi)生細(xì)菌的分離

將采集到的雪膽進(jìn)行內(nèi)生細(xì)菌分離，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在NA平板上長(zhǎng)出大量菌落，且菌落形態(tài)存在明顯差異，共得到30株內(nèi)生細(xì)菌，依次編號(hào)為KLXD01～KLXD30，這表明雪膽組織中存在大量的內(nèi)生細(xì)菌。

2.2抗MRSA內(nèi)生細(xì)菌的篩選

采用平板對(duì)峙法初篩、牛津杯法復(fù)篩，從所分離到的30株內(nèi)生細(xì)菌中共篩選出25株對(duì)MRSA具有抑制效果的菌株（表1），不同細(xì)菌菌株的抑菌效果存在明顯差異，KLXD06、KLXD17、KLXD21、KLXD24等4株菌抗MRSA的效果較好，其中KLXD06抗MRSA最大，抑菌圈直徑達(dá)19.3 mm。

2.3拮抗性雪膽內(nèi)生細(xì)菌ERIC-PCR分析

對(duì)25株拮抗性雪膽內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行ERIC-PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明，供試菌株ERIC-PCR圖譜多呈現(xiàn)3～5條條帶，其分布各不相同，其大小范圍100～1 500 bp（圖1），說(shuō)明不同菌株在分子水平上存在差異。

用DPS軟件系統(tǒng)采用類平均連鎖法（UPGMA）對(duì)這些菌株的ERIC-PCR結(jié)果進(jìn)行聚類分析，得到樹(shù)狀圖（圖2）。從圖2可以看出，在遺傳距離為0.71時(shí)，所有供試菌株聚在一起；在遺傳距離為0.50時(shí)，供試菌株進(jìn)一步被劃分為4個(gè)ERIC群和1個(gè)獨(dú)立成群的菌株，4個(gè)ERIC群分別命名為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ，每個(gè)群的菌株數(shù)依次為6、8、5、5株，中心菌株分別為KLXD01、KLXD08、KLXD12、KLXD10。

3結(jié)論與討論

雪膽植物內(nèi)生細(xì)菌非常豐富，筆者從雪膽中分離到30株內(nèi)生細(xì)菌。ERIC-PCR結(jié)果顯示，具有抗MRSA活性的25株菌株在遺傳距離為0.50時(shí)被分為4個(gè)ERIC群和1個(gè)獨(dú)立成群。

目前，我國(guó)以采用體外抑菌法從中草藥及其提取物中篩

選抗MRSA的物質(zhì)為主，其中黃岑、黃連等表現(xiàn)出較好的抑菌效果[15-17]，但中草藥成分復(fù)雜，分析其抑菌機(jī)制比較困難。多株已篩選出的放線菌對(duì)MRSA具有較好的抑制效果[11，18-19]。張守村等從苦豆子內(nèi)生細(xì)菌中篩選到1株抗MRSA活性較強(qiáng)的菌株[20]。從其他藥用植物內(nèi)生細(xì)菌中篩選抗MRSA菌株還鮮見(jiàn)報(bào)道。雪膽抗菌譜廣，其內(nèi)生細(xì)菌抗MRSA活性強(qiáng)，筆者從雪膽中分離到30株內(nèi)生細(xì)菌，有25株菌株具有較強(qiáng)的抗MRSA活性，其中雪膽內(nèi)生細(xì)菌KLXD06的抗MRSA活性最強(qiáng)，有生產(chǎn)抗MRSA活性藥物的潛力，但該菌株的系統(tǒng)發(fā)育地位還需要進(jìn)一步確定。

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